octubre de 2014 INFORME DE LA - OIE

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Original: Inglés Septiembre/octubre de 2014

INFORME DE LA REUNIÓN DE LA COMISIÓN DE NORMAS SANITARIAS PARA LOS ANIMALES ACUÁTICOS DE LA OIE París (Francia), 29 de septiembre–3 de octubre de 2014 ______ La Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos de la OIE (en lo sucesivo, Comisión para los Animales Acuáticos) se reunió en la Sede de la Organización del 29 de septiembre al 3 de octubre de 2014. La lista de participantes y el orden del día adoptado figuran en los Anexos 1 y 2. La Comisión para los Animales Acuáticos dio las gracias a los siguientes Países miembros por el envío de sus comentarios sobre los distintos proyectos de texto de la reunión de la Comisión en febrero: Australia, Canadá, Estados Unidos de América, los Estados Miembros de la Unión Europea (UE), Japón, Nueva Zelanda, Suiza, Taipéi Chino y la Unión Africana - Oficina interafricana de recursos animales (OAU-IBAR) en nombre de los Delegados de África. La Comisión pasó revista a los documentos identificados en el orden del día, examinó los comentarios remitidos por los Países miembros sobre el informe de febrero de 2014 e introdujo enmiendas en textos del Código sanitario para los animales acuáticos de la OIE (el Código acuático) y del Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos de la OIE (el Manual acuático) allí donde lo consideró oportuno. Las enmiendas se señalan del modo habitual, mediante doble subrayado y tachado, y figuran en los Anexos del informe. La Comisión para los Animales Acuáticos consideró todos los comentarios de los Países miembros. Los Países miembros deberán tener presente que, salvo indicación contraria, los textos presentados para comentario pueden someterse a aprobación durante la 82ª Sesión General de la OIE, que se celebrará en mayo de 2015. Según los comentarios recibidos sobre cada texto, la Comisión identificará los textos sometidos a aprobación en mayo de 2015 en el informe de su reunión de marzo de 2015. La Comisión para los Animales Acuáticos alienta encarecidamente a los Países miembros a colaborar con sus comentarios en la redacción de las normas internacionales de la OIE y, más tarde, a participar en el proceso de aprobación durante la Sesión General. Sería de gran utilidad que los comentarios se presentaran como propuestas específicas de modificación de texto, basadas en argumentos científicos. Las propuestas de supresión de texto deberán indicarse con tachado y las de modificación, con doble subrayado. Los Países miembros no deberán recurrir a la función automática de ‘control de cambios’ del procesador de textos, ya que dichos cambios se pierden al compilar las propuestas de los Países miembros en los documentos de trabajo de la Comisión. El cuadro presentado más abajo sintetiza los textos recogidos en los anexos. Los Anexos 3 a 20 se presentan para comentario de los Miembros; los Anexos 21 a 23, para su información. Los comentarios sobre el presente informe deberán hacerse llegar a la Sede de la OIE antes del 30 de enero de 2015, a fin de que puedan someterse a consideración durante la próxima reunión de la Comisión para los Animales Acuáticos, que se celebrará en marzo de 2015. Los comentarios deberán enviarse al Departamento de Comercio Internacional: [email protected] Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



Textos para comentario de los Países miembros

Número de anexo

Código acuático: Guía del usuario

Anexo 3

Glosario

Anexo 4

Notificación de enfermedades y datos epidemiológicos (Capítulo 1.1.)

Anexo 5

Enfermedades de la lista de la OIE (Capítulo 1.3.)

Anexo 6

Análisis del riesgo asociado a las importaciones (Capítulo 2.1.)

Anexo 7

Recomendaciones para la desinfección de la superficie de huevos de salmónidos (nuevo Capítulo 4.X.)

Anexo 8

Control de peligros asociados a los alimentos de los animales acuáticos (Capítulo 4.7.) Obligaciones generales en materia de certificación (Capítulo 5.1.)

Anexo 9

Procedimientos de certificación (Capítulo 5.2.)

Anexo 11

Análisis del riesgo de la resistencia a los agentes antimicrobianos derivado de su uso en los animales acuáticos (Capítulo 6.6.) Capítulos específicos de enfermedades de los anfibios (Capítulos 8.1. y 8.2.)

Anexo 12

Artículos X.X.7. y X.X.11. de capítulos específicos de enfermedad

Anexo 14

Correcciones en los Artículos 10.4.4. y 10.4.6.

Anexo 15

Anexo 10

Anexo 13A y 13B

Manual Acuático: Necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (Capítulo 2.2.2.)

Anexo 16

Hepatopancreatitis necrotizante (Capítulo 2.2.4.)

Anexo 17

Síndrome de Taura (Capítulo 2.2.5.)

Anexo 18

Enfermedad de la cabeza amarilla (Capítulo 2.2.8.)

Anexo 19

Infección por Perkinsus olseni (Sección 2.2.1. del Capítulo 2.4.6.)

Anexo 20

Anexos para información de los Países miembros Evaluación de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda de acuerdo con/según los criterios del Artículo 1.2.2.

Anexo 21

Infección por Perkinsus olseni (Capítulo 11.6.)

Anexo 22

Plan de trabajo de la Comisión para los Animales Acuáticos en 2014/2015

Anexo 23

Reunión con el Director General El Dr. Vallat dio la bienvenida a la Comisión para los Animales Acuáticos y le agradeció su apoyo y compromiso para lograr de los objetivos de la OIE. Señaló que era muy importante que la Comisión tuviera una visión amplia para elaborar normas y alcanzar otros objetivos de la OIE relacionados con la sanidad de los animales acuáticos. Reiteró su apoyo a todos los Grupos ad hoc que la Comisión desee convocar para respaldar su trabajo. El Dr. Vallat comentó que la inminente Conferencia mundial sobre la sanidad de los animales acuáticos, que se celebrará en Vietnam en enero de 2015, es un evento importante para la Comisión ya que ofrece la oportunidad de poner de relieve el trabajo de la OIE y también de desarrollar recomendaciones que orienten el futuro trabajo de la Comisión para los Animales Acuáticos y de la OIE. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



El Dr. Vallat indicó que la elección de todas las Comisiones Especializadas tendría lugar en mayo de 2015. Asimismo, comentó que el Consejo de la OIE estaba elaborando criterios de elegibilidad para los miembros de las Comisiones Especializadas, que se aplicarán en las elecciones de 2015 a fin de garantizar la excelencia continua/permanente de todos los miembros. El Dr. Vallat señaló que se había enviado un cuestionario a una lista seleccionada de Delegados para tratar de averiguar por qué la Herramienta PVS: Animales acuáticos había sido solicitada solo por un pequeño número de Delegados, en comparación con el gran éxito logrado por la Herramienta PVS dirigida a los animales terrestres. Las respuestas a este cuestionario se presentarán en la Conferencia mundial sobre la sanidad de los animales acuáticos de Vietnam. Asimismo, el Dr. Vallat reiteró que la OIE respetaba la independencia de los Servicios de Sanidad de los Animales Acuáticos en un País miembro y que la Herramienta PVS estaba diseñada para ayudar a un país a mejorar dichos servicios, tanto si estos están dentro de los Servicios Veterinarios, como de otro servicio ministerial. El Dr. Vallat apuntó que la OIE seguía llevando a cabo un trabajo muy importante en materia de resistencia a los agentes antimicrobianos y que recibía cada vez más peticiones de muchos sectores que solicitan que se trabajara sobre este tema. Añadió que se había solicitado a la OIE que trabaje sobre el desarrollo de criterios de jerarquización para guiar el desarrollo de vacunas (u otras alternativas) para los animales acuáticos y terrestres, con el objetivo de reducir el uso de agentes antimicrobianos en animales. El Dr. Vallat pidió que la Comisión contribuyera a este trabajo. 1.

Código Sanitario para los Animales Acuáticos de la OIE 1.1.

Guía del usuario La Comisión para los Animales Acuáticos examinó los comentarios de los Países miembros e hizo enmiendas pertinentes asegurando, en la medida de lo posible, la armonización con la edición de 2014 de la Guía del usuario del Código terrestre. En respuesta a los comentarios de varios Países miembros, la Comisión suprimió las palabras ‘Autoridades veterinarias de los Países miembros o a cualquier otra’ cuando aparecía junto a ‘Autoridad competente’, por considerarlas redundante. La Comisión para los Animales Acuáticos no se mostró de acuerdo con el comentario de un País miembro de reincorporar el punto 3 de la Introducción (‘El Código acuático no comprende actualmente ninguna enfermedad zoonótica; sin embargo, la salud pública veterinaria forma parte del mandato de la OIE, incluido en el ámbito de la sanidad de los animales acuáticos.’) por considerar que no es necesario guiar a los usuarios en materia de enfermedades zoonóticas ya que el Código acuático no aborda ninguna actualmente. La Comisión convino en que es más adecuado incluir ese punto en el Prefacio y sugirió que se incluyera en el Prefacio de la edición 2015 del Código acuático. La Guía del usuario revisada figura en el Anexo 3 para comentario de los Países miembros.

1.2.

Glosario La Comisión para los Animales Acuáticos propuso modificar las definiciones de ‘desinfectantes’ y ‘desinfección’ siguiendo la recomendación del Grupo ad hoc sobre desinfección (ver también Ítem 1.6.). La Comisión convino en que las definiciones revisadas reflejarán de manera más adecuada la utilización de estos términos en el Código acuático. DESINFECTANTES designa los compuestos químicos o procedimientos físicos capaces de destruir los microorganismos agentes patógenos o de detener su crecimiento o capacidad de supervivencia. DESINFECCIÓN designa la aplicación, después de una limpieza completa, de procedimientos destinados a destruir los agentes infecciosos o parasitarios responsables de enfermedades de los animales acuáticos, incluidas las zoonosis. Esta operación se aplica a los establecimientos de acuicultura (es decir, criaderos, piscifactorías, criaderos de ostras, criaderos de camarones, viveros, etc.) y a los vehículos y objetos/equipos diversos que puedan haber sido directa o indirectamente contaminados. designa el procedimiento de limpieza y aplicación de desinfectantes para inactivar los agentes patógenos en artículos potencialmente contaminados.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



La Comisión para los Animales Acuáticos propuso suprimir la definición de ‘Período de infecciosidad’ porque, siguiendo las enmiendas propuestas para el Capítulo 1.1. (ver Ítem 1.6.), esta definición solo aparecerá en el Capítulo 4.5. y su uso en el contexto de este Capítulo no requiere una definición específica.

PERÍODO DE INFECCIOSIDAD designa el período más largo durante el cual un animal acuático infectado puede ser fuente de infección. Asimismo, la Comisión para los Animales Acuáticos revisó las enmiendas propuestas por la Comisión del Código para el Glosario del Código terrestre y convino en hacer enmiendas similares en el Glosario del Código acuático para garantizar la armonización de ambos Códigos. La Comisión para los Animales Acuáticos apuntó que el Glosario no incluye actualmente una definición para ‘bioseguridad’ y acordó con la Comisión del Código desarrollar una definición que podría proponerse para su adopción en ambos Códigos. BIOSEGURIDAD designa el conjunto de medidas físicas y de gestión diseñadas para reducir el riesgo de introducción, desarrollo y propagación de los agentes patógenos hacia, desde y dentro de una población de animales acuáticos. La Comisión para los Animales Acuáticos acordó junto con la Comisión del Código que la actual definición de ‘identificación del riesgo’ añadía poco a la definición existente de peligro y podía, por tanto, suprimirse del Glosario. IDENTIFICACIÓN DEL RIESGO designa el proceso de identificación de los agentes patógenos que puede contener la mercancía que se prevé importar. ANÁLISIS DEL RIESGO designa el proceso que comprende la identificación del peligro, la evaluación del riesgo, la gestión del riesgo y la comunicación sobre el riesgo. La Comisión para los Animales Acuáticos señaló que la evaluación del riesgo se aplica más allá del contexto de las importaciones y, por consiguiente, acordó con la Comisión del Código suprimir “en el territorio de un país importador” en la definición de ‘evaluación del riesgo’. EVALUACIÓN DEL RIESGO designa la evaluación científica de la probabilidad y de las consecuencias biológicas y económicas de la entrada, radicación o propagación de un peligro en el territorio de un país importador. El Glosario revisado figura en el Anexo 4 para comentario de los Países miembros. 1.3.

Notificación de enfermedades y aportación de datos epidemiológicos (Capítulo 1.1.) En respuesta al comentario de un País miembro, la Comisión para los Animales Acuáticos modificó el punto 2 del Artículo 1.1.5. para eliminar la referencia al período de infecciosidad, ya que esta información no aparece especificada en el Código acuático. La Comisión enmendó el texto atendiendo las recomendaciones para ‘reconocer la ausencia de enfermedad’ incluidas en el Capítulo 1.4. y en los capítulos específicos de enfermedad de los Títulos 8 a 11. El Capítulo 1.1. revisado figura en el Anexo 5 para comentario de los Países miembros.

1.4.

Enfermedades de la lista de la OIE (Capítulo 1.3.) Enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda En su reunión de febrero de 2014, la Comisión para los Animales Acuáticos consideró la posible inscripción de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND, por sus siglas en inglés) en la lista de la OIE de acuerdo con el Artículo 1.2.2. ‘Criterios para inscribir una enfermedad de los animales acuáticos en la lista de la OIE’. La Comisión concluyó que, debido a la falta de métodos de diagnóstico específicos para el agente causal de esta enfermedad, no podía proponerse su inscripción d en la lista de la OIE en ese momento. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



En esa reunión, la Comisión para los Animales Acuáticos reconoció la importancia de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda para muchos países y, a la luz del desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico, la Comisión reconsideró la inscripción de dicha enfermedad. La Comisión llevó a cabo una evaluación para su inscripción en la lista de la OIE de acuerdo con el Artículo 1.2.2. y concluyó que ahora sí reúne los criterios pertinentes para su inscripción. A la luz de la propuesta de la Comisión para los Animales Acuáticos de inscribir la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda en la lista de la OIE y tras reconocer que es esencial diferenciar el agente causal de esta enfermedad de otras cepas de la bacteria, la Comisión recomendó que se convocara un Grupo ad hoc encargado de desarrollar un capítulo sobre esta enfermedad para incluir en el Manual Acuático. Además, la Comisión para los Animales Acuáticos actualizó la ficha técnica de la necrosis hepatopancreática aguda, disponible en el sitio web de la OIE: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_Setting/docs/pdf/Aquatic_Commission/AH PND_DEC_2013.pdf La evaluación para la inscripción de esta enfermedad desarrollada por la Comisión figura en el Anexo 21 para información de los Países miembros. El Capítulo 1.3. revisado figura en el Anexo 6 para comentario de los Países miembros. 1.5.

Análisis del riesgo asociado a las importaciones (Capítulo 2.1.) La Comisión para los Animales Acuáticos analizó las modificaciones en el capítulo correspondiente del Código Terrestre, aprobadas por la Asamblea Mundial de Delegados celebrada en mayo de 2014, en la que se suprimió el texto que no era directamente aplicable al análisis del riesgo asociado a las importaciones. La Comisión acordó hacer algunas enmiendas en el capítulo del Código acuático por considerar importante la coherencia de tales capítulos horizontales en ambos Códigos. Igualmente, propuso suprimir ‘posibles’ en la expresión ‘posibles peligros’ en todo el capítulo ya que este término es inexacto a la hora de calificar el tipo de peligro, enmienda que también fue aprobada en el Código terrestre. El Capítulo 2.1. revisado figura en el Anexo 7 para comentario de los Países miembros.

1.6.

Recomendaciones generales sobre la desinfección (Capítulo 4.3.) y Recomendaciones para la desinfección de la superficie de huevos de salmónidos (nuevo Capítulo 4.X.) Recomendaciones generales sobre la desinfección (Capítulo 4.3.) La Comisión para los Animales Acuáticos reiteró que, durante su reunión de febrero de 2014, había revisado el Capítulo 1.1.3. ‘Métodos de desinfección de los establecimientos de acuicultura’ del Manual Acuático de la OIE y había decidido que este capítulo no tenía razón de ser en esta publicación. La Comisión acordó también que el Capítulo 4.3. ‘Recomendaciones generales sobre la desinfección’ del Código acuático debía revisarse para abordar mejor este tema. La Comisión apuntó que el Capítulo 1.1.3. del Manual Acuático se suprimirá a la espera del capítulo revisado del Código acuático. La Comisión para los Animales Acuáticos revisó el anteproyecto del Capítulo 4.3. redactado por el Grupo ad hoc sobre desinfección y convino en que proporciona un buen marco para el capítulo revisado. La Comisión recomendó que el Grupo ad hoc siga trabajando en el desarrollo de este capítulo. Recomendaciones para la desinfección de la superficie de huevos de salmónidos (nuevo Capítulo 4.X.) La Comisión para los Animales Acuáticos examinó el proyecto de documento desarrollado por el Grupo ad hoc sobre desinfección acerca de las ‘Recomendaciones para la desinfección de la superficie de huevos de salmónidos’. La Comisión acordó que este texto debe proponerse como un nuevo Capítulo 4.X. ‘Recomendaciones para la desinfección de la superficie de huevos de salmónidos’ en el Título 4 ‘Prevención y control de las enfermedades’ del Código acuático.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



La Comisión para los Animales Acuáticos explicó qué, una vez aprobado el proyecto de Capítulo 4.X. propuesto, la referencia cruzada a un protocolo sobre desinfección de huevos de salmónidos que figura actualmente en los Capítulos 10.4., 10.5., 10.6. y 10.10. se modificará como sigue: ‘a)

los huevos deberán desinfectarse antes de la importación, de acuerdo con los métodos descritos en el Capítulo 4.X 1.1.3. del Manual Código acuático (en estudio) o los especificados por la Autoridad competente del país importador, y’

La Comisión para los Animales Acuáticos reconoció la necesidad de ampliar las recomendaciones para la desinfección de la superficie de los huevos de salmónidos a otras especies acuáticas animales, según proceda, y solicitó que el Grupo ad hoc sobre desinfección aborde este tema en su futuro trabajo. El nuevo proyecto de Capítulo 4.X. figura en el Anexo 8 para comentario de los Países miembros. 1.7.

Control de peligros asociados a los alimentos de los animales acuáticos (Capítulo 4.7.) La Comisión para los Animales Acuáticos recordó a los Países miembros que había propuesto revisar el Capítulo 4.7. ‘Control de peligros asociados a los alimentos de los animales acuáticos’. La Comisión preparó un proyecto de capítulo revisado, en línea con la finalidad y el ámbito de aplicación acordados durante la reunión de octubre de 2013. El capítulo revisado aborda exclusivamente el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas de los animales acuáticos a través de los alimentos y la prevención de la entrada de los agentes patógenos en cuestión también a través de los alimentos. El capítulo revisado pretende ayudar a los Países miembros a identificar vías de riesgo y a evaluar los riesgos relacionados con los agentes patógenos en los alimentos. A la vista del importante número de cambios propuestos, el capítulo revisado se propone solo como texto limpio. El Capítulo 4.7. revisado figura en el Anexo 9 para comentario de los Países miembros.

1.8.

Obligaciones generales en materia de certificación (Capítulo 5.1.) En respuesta a los comentarios de los Países miembros, la Comisión para los Animales Acuáticos enmendó los puntos 1 y 2 del Artículo 5.1.2. a fin de evitar el uso de la expresión ‘nivel de protección adecuado’ en el Código acuático, excepto cuando se refiere directamente al Acuerdo sobre medidas sanitarias y fitosanitarias de la Organización Mundial del Comercio, y para reemplazar la expresión ‘más restrictivas’ por ‘más estrictas’. La Comisión para los Animales Acuáticos informó de que estas modificaciones concordaban con las propuestas por la Comisión del Código para el capítulo correspondiente del Código terrestre. El Capítulo 5.1. revisado figura en el Anexo 10 para comentario de los Países miembros.

1.9.

Procedimientos de certificación (Capítulo 5.2.) La Comisión del Código acepto las sugerencias de los Países miembros de reemplazar el término “documentación” por “intercambio electrónico de datos” del punto 1 del Artículo 5.2.4. con el fin de modificar la referencia a la asistencia para la certificación electrónica en el apartado b del punto 1 del Artículo 5.2.4., e introducir un nuevo apartado c en el punto 1 sobre los métodos seguros de intercambio electrónico de datos. La Comisión para los Animales Acuáticos señaló que estas enmiendas concordaban con las propuestas por la Comisión del Código para el capítulo correspondiente en el Código terrestre. El Capítulo 5.2. revisado figura en el Anexo 11 para comentario de los Países miembros.

1.10. Proyecto de Capítulo 6.6. ‘Análisis del riesgo asociado a la resistencia a los agentes antimicrobianos como consecuencia del uso en animales acuáticos’ La Comisión para los Animales Acuáticos revisó el proyecto de Capítulo 6.6. ‘Análisis del riesgo asociado a la resistencia a los agentes antimicrobianos como consecuencia del uso de agentes antimicrobianos en animales acuáticos’ desarrollado por el Grupo ad hoc sobre el uso de antibióticos en los animales acuáticos. La Comisión explicó que el proyecto de capítulo incluye el Artículo 6.6.2. ‘Consideraciones especiales para efectuar un análisis del riesgo de resistencia a los agentes antimicrobianos en acuicultura’ para poner de relieve las diferencias de dichos análisis entre los animales terrestres y los acuáticos. El nuevo Capítulo 6.6. revisado figura en el Anexo 12 para comentario de los Países miembros. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



1.11. Capítulos específicos de enfermedades de los anfibios (8.1. y 8.2.) La Comisión para los Animales Acuáticos reconoció la necesidad de modificar los Artículos 8.1.10. y 8.2.10. de los capítulos específicos de enfermedades de los anfibios ya que en su estado actual incluyen una alusión a los animales acuáticos vivos destinados a los laboratorios, a los parques zoológicos y al comercio de mascotas, lo cual refleja aspectos concretos del comercio internacional de los anfibios. La Comisión apuntó que la importación de anfibios vivos para ser mantenidos en laboratorios, parques zoológicos o como mascotas comporta un nivel de riesgo diferente comparado con el uso agrícola, industrial o farmacéutico. Por consiguiente, la Comisión para los Animales Acuáticos propuso nuevos Artículos 8.1.13. y 8.2.13. para referirse a los anfibios vivos destinados al uso en laboratorios y parques zoológicos. Además, la Comisión propuso modificar los Artículos 8.1.10. y 8.2.10. para abordar concretamente el distinto nivel de riesgo para animales destinados al uso en laboratorios y parques zoológicos, con respecto a aquellos destinados a uso agrícola, industrial o farmacéutico. Para la Infección por Batrachochytrium dendrobatidis (Capítulo 8.1.), la Comisión para los Animales Acuáticos reconoció la incoherencia entre el Código acuático y el Manual Acuático en las recomendaciones de tratamiento antes de la importación de anfibios destinados al comercio de mascotas. Tal como se describe en el Manual Acuático, la Comisión acordó que el tratamiento de animales vivos antes de su importación no se considera una medida apropiada de gestión del riesgo. La Comisión propuso, por tanto, eliminar la disposición sobre el tratamiento de animales acuáticos vivos para erradicar la infección de los Artículos 8.1.8. y 8.1.10. La Comisión para los Animales Acuáticos reconoció que el comercio de animales acuáticos como mascotas era una vía de importación importante que debería tratarse en el futuro. Los Artículos revisados 8.1.8., 8.1.10. y 8.1.13., y 8.2.10. y 8.2.13. figuran en los Anexos 13A y 13B para comentario de los Países miembros. 1.12. Artículos X.X.7. y X.X.11. de los capítulos específicos de enfermedad La Comisión para los Animales Acuáticos reconoció que el texto de los Artículos X.X.7. y X.X.11. de los capítulos específicos de enfermedad era casi idéntico. Estos artículos se aplican a la importación de animales acuáticos vivos (Artículo X.X.7.) y a la importación de productos de animales acuáticos (Artículo X.X.11.) de un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de enfermedad X. [Nota: este tema concierne a los Artículos 10.4.10., 10.4.11., 10.4.15. y 10.4.16. del Capítulo 10.4.] La Comisión para los Animales Acuáticos propuso unir ambos Artículos para mejorar su lectura. El modelo de Artículo X.X.7. y X.X.11. revisado figura en el Anexo 14 para comentario de los Países miembros. 1.13. Correcciones en los Artículos 10.4.4. y 10.4.6. La Comisión para los Animales Acuáticos reconoció que el texto del punto 2 de los Artículos 10.4.4. y 10.4.6. del Capítulo 10.4. era incorrecto. La Comisión propuso una corrección pertinente. Los Artículos 10.4.4. y 10.4.6. revisados figuran en el Anexo 15 para información de los Países miembros. 1.14. Infección por Perkinsus olseni (Capítulo 11.6.) La Comisión para los Animales Acuáticos resaltó la necesidad de enmendar el Artículo 11.6.2. como consecuencia del cambio propuesto en el capítulo correspondiente del Manual Acuático (ver también Ítem 2.2.3.). La Comisión señaló que esta enmienda se propondrá para aprobación en 2015, junto con el correspondiente capítulo enmendado del Manual Acuático. El Artículo 11.6.2. revisado figura en el Anexo 22 para información de los Países miembros.

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1.15. Criterios de inscripción de especies susceptibles de infección por un agente patógeno específico Tras la adopción de un nuevo Capítulo 1.5. ‘Criterios de inscripción de especies susceptibles de infección por un agente patógeno específico’ durante la Sesión General de 2014, la Comisión para los Animales Acuáticos debatió sobre los siguientes pasos a seguir para aplicar progresivamente los criterios a cada enfermedad de la lista de la OIE. La Comisión se mostró de acuerdo en convocar un Grupo ad hoc para iniciar las evaluaciones de todas las enfermedades de crustáceos de la lista de la OIE, empezando por la enfermedad de la cabeza amarilla como enfermedad piloto. La Comisión para los Animales Acuáticos recomendó que se convocara un nuevo Grupo ad hoc para iniciar este trabajo. 2.

Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos 2.1.

Revisión de los capítulos del Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos 2.2.1.

Cuatro capítulos de crustáceos En respuesta a los comentarios de un País miembro sobre los Capítulos 2.2.2. Necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa; 2.2.4. Hepatopancreatitis necrotizante; 2.2.5. Síndrome de Taura, y 2.2.8. Enfermedad de la cabeza amarilla, la Comisión para los Animales Acuáticos y los autores de los capítulos analizaron los comentarios y modificaron el texto en consecuencia. Los Capítulos 2.2.2., 2.2.4., 2.2.5. y 2.2.8. revisados figuran en los Anexos 16 a 19 para comentario de los Países miembros.

2.2.

Otras cuestiones sobre el Manual Acuático 2.2.1.

Validación de las pruebas de diagnóstico La Comisión para los Animales Acuáticos señaló que la información sobre la validación y los resultados de los ensayos en el Manual Acuático es incoherente de un capítulo a otro y, en algunos casos, falta. La Comisión solicitó que se pidiera a expertos del Laboratorio de Referencia la actualización de esta información siguiendo un formato estándar.

2.2.2.

Información sobre la estabilidad del agente La Comisión para los Animales Acuáticos mostró su acuerdo con la recomendación del Grupo ad hoc sobre desinfección (ver también Ítem 1.6.) para que el Manual Acuático proporcione información más coherente sobre la estabilidad del agente, incluida la eficacia de los desinfectantes, siempre que haya información disponible. La Comisión solicitó que se pidiera a expertos del Laboratorio de Referencia que revisaran y actualizaran apropiadamente esta información.

2.2.3.

Inscripción de Crassostrea gigas como especie susceptible de infección por Perkinsus olseni (Capítulo 2.4.6.) La Comisión para los Animales Acuáticos tomó en consideración el comentario de un País miembro acerca de la justificación para la inscripción de Crassostrea gigas como especie hospedadora susceptible en los capítulos del Código acuático y del Manual Acuático sobre la infección por Perkinsus olseni. La Comisión consultó al experto del Laboratorio de Referencia, que confirmó que no había información que corroborara que Crassostrea gigas es susceptible de infección por P. olseni. Por consiguiente, la Comisión acordó retirar Crassostrea gigas de la lista de especies susceptibles del Código acuático (Capítulo 11.6.) (ver también Ítem 1.14.) y del Capítulo 2.4.6. del Manual Acuático. La sección 2.2.1. revisada del Capítulo 2.4.6. figura en el Anexo 20 para comentario de los Países miembros.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 



2.2.4.

Infección por Xenohaliotis californiensis (Capítulo 2.4.7.) La Comisión para los Animales Acuáticos examinó la propuesta de un País miembro para que el Capítulo 2.4.7. Infección por Xenohaliotis californiensis se actualizara e incluyera una prueba de diagnóstico publicada recientemente. La Comisión pidió que esta propuesta se remitiera al experto del Laboratorio de Referencia para su consideración.

2.2.5.

Documentos de orientación referidos específicamente a la vigilancia de una enfermedad de los crustáceos La Comisión para los Animales Acuáticos revisó el documento ‘Vigilancia del virus de las manchas blancas’ y solicitó que se publique en las páginas Internet de la Comisión. La Comisión para los Animales Acuáticos recordó a los Países miembros que los documentos sobre ‘Vigilancia de la infección por Bonamia ostreae’ y ‘Vigilancia de la septicemia hemorrágica viral’ también están disponibles en las páginas web de la Comisión:  http://www.oie.int/en/international-standard-setting/specialists-commissions-groups/aquaticanimal-commission-reports/other-reports/ La Comisión para los Animales Acuáticos explicó que dichos documentos proporcionaban información valiosa a los Países miembros y orientación práctica sobre la implementación de las normas de vigilancia de la OIE.

3.

Centros de Referencia de la OIE Se puso al día a la Comisión para los Animales Acuáticos acerca de las propuestas de la Comisión de Normas Biológicas sobre los Centros de Referencia. A la vista del número creciente de candidaturas para la designación como Laboratorio de Referencia de la OIE, cada vez resulta más ardua la tarea de evaluar y controlar los resultados de los laboratorios. La Comisión de Normas Biológicas propuso que todos los futuros candidatos debían ser laboratorios de referencia nacional para la enfermedad en cuestión, antes de presentar una solicitud para la designación como Laboratorio de Referencia de la OIE. Además, dado que los sistemas de gestión de la calidad son esenciales, la Comisión de Normas Biológicas convino en que todos los Laboratorios de Referencia de la OIE debían estar acreditados con arreglo a la norma ISO 17025 o equivalente. Este requisito deberá aplicarse a todos los nuevos candidatos. A los Laboratorios de Referencia de la OIE existentes que todavía no estén acreditados, se les concederá tres años para que cumplan con este requisito. Se pedirá a los Laboratorios que anexen una copia de sus certificados de acreditación en sus informes anuales. La Comisión para los Animales Acuáticos tomó nota de estas propuestas y animó a los Países miembros a considerar las implicaciones para los Laboratorios de Referencia de la OIE para las enfermedades de los animales acuáticos y a someter sus comentarios a la consideración de la Comisión para los Animales Acuáticos.

4.

Proyectos de hermanamiento Se informó a la Comisión para los Animales Acuáticos acerca de la situación de los proyectos de hermanamiento de las enfermedades de los animales acuáticos. En septiembre de 2014, se completó un proyecto (Canadá con Chile para la anemia infecciosa del salmón), dos están en fase de realización (Estados Unidos con China para la necrosis hematopoyética infecciosa, Noruega con Brasil para la anemia infecciosa del salmón), y otros dos han sido aprobados y en fase inicial (Estados Unidos con Indonesia para las enfermedades del camarón, Japón con Indonesia para la herpesvirosis de la carpa koi). Se destacó que el laboratorio de Chile se había convertido en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la infección por el virus de la anemia infecciosa del salmón en mayo de 2014, tras haber finalizado el proyecto de hermanamiento. La Comisión para los Animales Acuáticos revisó la propuesta de proyecto de hermanamiento para la encefalopatía y retinopatía virales, y proporcionó comentarios técnicos.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

10 

5.

Programa de trabajo de la Comisión para los Animales Acuáticos 2014/2015 La Comisión para los Animales Acuáticos examinó y actualizó su programa de trabajo en el que presenta un panorama general de las actividades actuales y futuras. El programa de trabajo de la Comisión para los Animales Acuáticos 2014/15 figura en el Anexo 23 para información de los Países miembros.

6.

Tercera Conferencia Mundial de los Centros de Referencia de la OIE, Seúl (República de Corea), 14–16 de octubre de 2014 La Comisión para los Animales Acuáticos señaló que el proyecto de programa para la Tercera Conferencia Mundial de los Centros de Referencia de la OIE incluía una sesión paralela sobre las enfermedades de los animales acuáticos. La Comisión especificó que está sesión especial ofrecería una oportunidad de informar mejor a los expertos designados de la OIE acerca de los avances más recientes en el trabajo de la Comisión. Además, mencionó que esta sesión abordaría cuestiones específicas importantes como la validación de las pruebas de diagnóstico, la coherencia a la hora de clasificar los métodos de diagnóstico en lo que respecta a su propósito y la garantía de calidad en los Centros de Referencia de la OIE.

7.

Tercera Conferencia Mundial de la OIE sobre la Sanidad de los Animales Acuáticos: ‘Preparar el futuro’, Ho Chi Minh City (Vietnam), 20-22 de enero de 2015 La Comisión para los Animales Acuáticos subrayó que la próxima Conferencia Mundial sobre la Sanidad de los Animales Acuáticos (20–22 de enero de 2015 en Ho Chi Minh City, Vietnam) era un evento importante para la Comisión ya que ofrecerá un foro para debatir sobre conceptos importantes de la sanidad de los animales acuáticos y porque las recomendaciones serán importantes para guiar el futuro trabajo de la Comisión y de la OIE. Toda la información pertinente acerca de la conferencia puede encontrarse en http://oie.int/esp/A_AAHRWF2015/introduction.htm

8.

Otras cuestiones 8.1.

Jerarquización de enfermedades para el desarrollo de vacunas Se informó a la Comisión para los Animales Acuáticos de una propuesta consistente en jerarquizar las enfermedades a fin de guiar el desarrollo de vacunas para los animales acuáticos y terrestres, con el objetivo de reducir el uso de agentes antimicrobianos en los animales. La Comisión pidió que se la mantuviera informada del avance de esta propuesta y manifestó su voluntad de participar si necesario.

9.

Próxima reunión La próxima reunión se llevará a cabo entre el 2 y el 6 de marzo de 2015.

_____________

.../Anexos Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 1

INFORME DE LA REUNIÓN DE LA COMISIÓN DE NORMAS SANITARIAS PARA LOS ANIMALES ACUÁTICOS DE LA OIE París (Francia), 29 de septiembre–3 de octubre de 2014 _______ Lista de participantes MIEMBROS DE LA COMISIÓN Dr Franck Berthe Presidente European Food Safety Authority - EFSA Head of the Animal and Plant Health Unit Risk Assessment and Scientific Assistance Via Carlo Magno 1, Parma ITALIA Tel.: + 39 052 1 036 870 Fax: + 39 052 1 036 0870 [email protected]

Dr Jie Huang Vicepresidente Maricultural Organism Diseases Control & Molecular Pathology Laboratory, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences 106 Nanjing Road Qingdao, SD 266071 PR CHINA Tel.: +86 532 858 230 62 Fax: +86-532-858 11514 [email protected]

Dr Victor Manuel Vidal Martínez Vicepresidente Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Carretera Antigua a Progreso Km. 6 Apartado Postal 73 Cordemex Mérida, Yucatán C.P. 97310 MÉXICO Tel.: +52 99 99 42 94 72 Fax: +52 99 81 29 17 [email protected]

Dr Ingo Ernst Director Aquatic Pest and Health Policy Animal Division Department of Agriculture 18 Marcus Clarke Street Canberra ACT 2601 AUSTRALIA Tel.: +61 2 6272 5615 [email protected]

Dr Brit Hjeltnes Deputy Director, Fish and Shellfish Health National Veterinary Institute PO Box 750 Sentrum, N-0106 Bergen NORUEGA Tel.: +47 918 893 76 [email protected]

Dr Alicia Gallardo Lagno Subdirectora nacional de acuicultura Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura Calle Victoria 2832 CHILE Tel.: +56 32 281 9282 [email protected]

Dr Derek Belton Jefe Departamento de comercio internacional OIE [email protected]

Ms Sara Linnane Secretaria de redacción científica Departamento científico y técnico OIE [email protected]

SEDE DE LA OIE  Dr Bernard Vallat Director General 12, rue de Prony 75017 Paris FRANCIA Tel.: 33 - (0)1 44 15 18 88 Fax: 33 - (0)1 42 67 09 87 [email protected]

Dr Gillian Mylrea Jefa adjunta Departamento de comercio internacional OIE [email protected]  

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Anexo 2

INFORME DE LA REUNIÓN DE LA COMISIÓN DE NORMAS SANITARIAS PARA LOS ANIMALES ACUÁTICOS DE LA OIE París (Francia), 29 de septiembre–3 de octubre de 2014 _______ Temario aprobado 1.

Código sanitario para los animales acuáticos de la OIE 1.1.

Guía del usuario

1.2.

Glosario

1.3.

Notificación de enfermedades y aportación de datos epidemiológicos (Capítulo 1.1.)

1.4.

Enfermedades de la lista de la OIE (Capítulo 1.3.)

1.5.

Análisis del riesgo asociado a las importaciones (Capítulo 2.1.)

1.6.

Recomendaciones generales sobre la desinfección (Capítulo 4.3.) y Recomendaciones para la desinfección de la superficie de huevos de salmónidos (nuevo Capítulo 4.X.)

1.7.

Control de peligros asociados a los alimentos de los animales acuáticos (Capítulo 4.7.)

1.8.

Obligaciones generales en materia de certificación (Capítulo 5.1.)

1.9.

Procedimientos de certificación (Capítulo 5.2.)

1.10. Proyecto de Capítulo 6.6. ‘Análisis del riesgo asociado a la resistencia a los agentes antimicrobianos como consecuencia de su uso en los animales acuáticos’ 1.11. Capítulos específicos de enfermedades de los anfibios (8.1. y 8.2.) 1.12. Artículos X.X.7. y X.X.11. de los capítulos específicos de enfermedad 1.13. Correcciones en los Artículos 10.4.4. y 10.4.6. 1.14. Infección por Perkinsus olseni (Capítulo 11.6.) 1.15. Criterios de inscripción de especies susceptibles de infección por un agente patógeno específico 2.

Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2.1.

Revisión de los capítulos del Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2.1.1. Cuatro capítulos de crustáceos

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

14

Anexo 2 (cont.) 2.2.

Otras cuestiones sobre el Manual Acuático 2.2.1. Validación de las pruebas de diagnóstico 2.2.2. Información sobre la estabilidad del agente 2.2.3. Inscripción de Crassostrea gigas como especie susceptible de infección por Perkinsus olseni (Capítulo 2.4.6.) 2.2.4. Infección por Xenohaliotis califormiensis (Capítulo 2.4.7.) 2.2.5. Documentos de orientación referidos específicamente a la vigilancia de una enfermedad de los crustáceos

3.

Centros de Referencia de la OIE

4.

Proyectos de hermanamiento

5.

Programa de trabajo de la Comisión para los Animales Acuáticos 2014/2015

6.

Tercera Conferencia Mundial de los Centros de Referencia de la OIE, Seúl (República de Corea), 14–16 de octubre de 2014 

7.

Conferencia Mundial de la OIE sobre la Sanidad de los Animales Acuáticos: ‘Preparar el futuro’

8.

Otras cuestiones 8.1.

9.

Jerarquización de enfermedades para la fabricación de vacunas

Próxima reunión _____________ 

                Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

15 

Anexo 3

GUÍA DEL USUARIO PARA LA UTILIZACIÓN DEL CÓDIGO SANITARIO PARA LOS ANIMALES ACUÁTICOS A. Introducción 1)

El Código sanitario para los animales acuáticos (en lo sucesivo, Código acuático) establece brinda normas para la mejora mundial de la sanidad de los animales acuáticos. Más recientemente, eEl Código acuático ha incluidoincluye igualmente normas para el bienestar de los peces de cultivo y el uso de los agentes antimicrobianos en los animales acuáticos. La finalidad de esta guía es ayudar a las Autoridades Veterinarias y otras Autoridades Competentes de los Países miembros de la OIE a utilizar el Código acuático.

2)

Las Autoridades Veterinarias y otras Autoridades Competentes deberán emplear las normas del Código acuático para instaurar desarrollar medidas en materia de detección precoz, declaración, notificación y control de agentes patógenos en animales acuáticos (anfibios, crustáceos, peces y moluscos), que impidan la propagación de dichos agentes a través del comercio internacional de animales acuáticos y productos de animales acuáticos sin imponer barreras sanitarias injustificadas al comercio.

3)

El Código acuático no comprende actualmente ninguna enfermedad zoonótica; sin embargo, la salud pública veterinaria forma parte del mandato de la OIE, incluido en el ámbito de la sanidad de los animales acuáticos.

34) Las normas de la OIE se basan en la información científica y técnica más reciente. Si se aplican correctamente, protegen la sanidad de los animales acuáticos durante la producción y el comercio de animales acuáticos y productos de animales acuáticos así como y el bienestar de los peces de cultivo durante la producción y el comercio de animales acuáticos y productos de animales acuáticos. 45) La ausencia de capítulos, artículos o recomendaciones sobre agentes patógenos o mercancías específicos no significa que las Autoridades Veterinarias y otras Autoridades Competentes no puedan aplicar las debidas medidas de sanidad y bienestar animal. Sin embargo, esas medidas basadas en el análisis de riesgo de acuerdo con lo establecido en el Código acuático. deberán basarse en una sólida justificación científica de conformidad con los principios del Acuerdo para la aplicación de las medidas sanitarias y fitosanitarias de la OMC (Acuerdo MSF). 56) El texto completo del Código acuático se halla disponible en el sitio web de la OIE y puede descargarse desde http://www.oie.int. B. Contenido del Código acuático 1)

Las palabras y expresiones clave empleadas en más de un capítulo del Código acuático con un significado contextual se definen en el glosario. Al leer y utilizar el Código acuático, el lector deberá ser consciente de las definiciones recogidas en el glosario; las palabras que cuentan con una definición aparecen en cursiva. En la versión en línea del Código acuático, un hipervínculo permite acceder directamente a la correspondiente definición.

2)

La anotación "(en estudio)", que figura en contadas ocasiones en referencia a un artículo o parte de este, significa que esa parte del texto todavía no ha sido aprobada por la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE y esas disposiciones no forman parte aún del Código acuático.

3)

Las normas de los capítulos del Título 1 tratan de la aplicación de medidas en materia de diagnóstico, vigilancia y notificación de agentes patógenos. La sección Iincluyen los criterios para la inscripción de los animales acuáticos, las enfermedades de la lista de la OIE, y los procedimientos de notificación a la OIE y los criterios para las especies susceptibles a la infección por un agente patógeno específico.

4)

Las normas de los capítulos del Título 2 tratan de orientar al país importador para la realización de análisis del riesgo asociado a las importaciones en ausencia de normas comerciales de la OIE. El país importador también podrá usar esas normas para justificar medidas de importación que restrinjan más el comercio más estrictas que las normas comerciales existentes de la OIE.

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Anexo 3 (cont.)

5)

Las normas de los capítulos del Título 3 tratan del establecimiento, de la conservación y de la evaluación de los Servicios de sanidad de los animales acuáticos, incluida la comunicación. Esas normas pretenden ayudar a los Servicios veterinarios y los Servicios de sanidad de los animales acuáticos de los Países miembros a cumplir sus objetivos de mejora de la sanidad de los animales acuáticos y del bienestar de los peces de cultivo, y a crear y mantener la confianza en sus certificados sanitarios internacionales aplicables a los animales acuáticos.

6)

Las normas de los capítulos del Título 4 tratan de la aplicación de medidas en materia de prevención y control de agentes patógenos. Incluyen la zonificación, la compartimentación, la desinfección, los planes de contingencia, y la eliminación de residuos de animales acuáticos y el control de los peligros en los alimentos para los animales acuáticos.

7)

Las normas de los capítulos del Título 5 tratan de la aplicación de medidas sanitarias generales al comercio. En particular, los capítulos abordan la certificación y las medidas aplicables por los países de exportación, tránsito e importación. Este título Se incluyebrindan igualmente diversos modelos de certificados sanitarios como documentación coherente que deben emplearse como base armonizada para el comercio internacional.

8)

Las normas de los capítulos del Título 6 pretenden garantizar el uso responsable y prudente de los agentes antimicrobianos en los animales acuáticos.

9)

Las normas de los capítulos del Título 7 tratan de la aplicación de medidas para el bienestar de los peces de cultivo. Esas normas cubren los principios generales de bienestar de los peces de cultivo, el bienestar de estos durante el transporte, en el momento del aturdimiento, y de la matanza para consumo humano, así como en la situación de su y la matanza con fines de control sanitario.

10) Las normas de cada uno de los capítulos de los Títulos 8 a 11 están destinadas a impedir que los agentes patógenos etiológicos de las enfermedades de la lista de la OIE se introduzcan en un país importador. Cada capítulo de enfermedad incluye una lista de las especies susceptibles actualmente conocidas. y Las normas tienen en cuenta la naturaleza de la mercancía comercializada, el estatus sanitario respecto de los animales acuáticos del país, de la zona o del compartimento de exportación, y las medidas de atenuación del riesgo aplicables a cada mercancía. Esas normas parten del supuesto que el agente no está presente en el país importador o bien es objeto de un programa de control o de erradicación. Los Títulos 8 a 11 se distribuyen en función de que los hospedadores sean anfibios, crustáceos, peces o moluscos, respectivamente. Los capítulos contemplan medidas específicas para prevenir y controlar las infecciones de interés mundial. C. Cuestiones específicas 1)

Notificación El Capítulo 1.1. describe las obligaciones de los Países miembros en virtud de los Estatutos Orgánicos de la OIE. Las enfermedades de la lista de la OIE del Capítulo 1.1. y las enfermedades emergentes, en su caso, son de declaración obligatoria. Se invita a los Países miembros a proporcionar también a la OIE información sobre cualquier otro episodio zoosanitario acuático significativo desde el punto de vista epidemiológico, incluyendo el surgimiento de enfermedades emergentes. El Capítulo 1.2. describe los criterios de inscripción de una enfermedad en la lista de la OIE. El Capítulo 1.3. plasma especifica la lista de enfermedades de la OIE. Las enfermedades se dividen en cuatro categorías, correspondientes a los anfibios, crustáceos, peces o moluscos, respectivamente.

2)

Diferenciación de agentes patógenos Algunos agentes patógenos tienen una o más variantes. El Código acuático reconoce la existencia de variantes de alta patogenicidad y la necesidad de diferenciarlas de variantes más benignas. Cuando un agente patógeno tenga cepas estables, con características utilizables a efectos diagnósticos y con diferentes niveles de patogenicidad, deberán aplicarse distintas las normas de protección deberán adecuarse proporcionales al riesgo que entrañan las diversas cepas de dicho agente. La infección por virus de la anemia infecciosa del salmón es una primera enfermedad de la lista que incluye opciones de gestión del riesgo basadas en la diferenciación de cepas es la infección por virus de la anemia infecciosa del salmón. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 3 (cont.)

3)

Determinación de la susceptibilidad de las especies El Código acuático propone utilizar criterios para determinar la susceptibilidad de las especies hospedadoras a los agentes patógenos de las enfermedades de la lista del Código acuático. Esto reviste particular importancia es importante en el contexto de la acuicultura, dado el sinfín de especies y el número de especies nuevas existentes en este ámbito.

4)

Requisitos comerciales Las medidas sanitarias aplicables a los animales acuáticos a efectos del comercio internacional deberán basarse en las normas de la OIE. Un País miembro puede autorizar la importación de animales acuáticos o de productos de animales acuáticos a su territorio en virtud de requisitos más o menos restrictivos que los recomendados en el Código acuático. Para justificar científicamente Si las medidas comerciales son más restrictivas que las normas de la OIE, el país importador deberá presentar una justificación científica mediante llevar a cabo un análisis del riesgo de acuerdo con las normas de la OIE en la materia, descritas en el Capítulo 2.1. Los Miembros de la Organización Mundial del Comercio deberán remitirse al Acuerdo sobre medidas sanitarias y fitosanitarias. Los Capítulos 5.1. a 5.3. describen las obligaciones y las normas de responsabilidades éticas de los países importadores y exportadores en materia de comercio internacional. Las Autoridades Veterinarias y otras Autoridades Competentes así como todos los veterinarios o certificadores oficiales que participen directamente en el comercio internacional deberán familiarizarse con estos capítulos. Elstos cCapítulos 5.3. proporcionan directrices para la mediación informal de la OIE. Los capítulos de enfermedades del Código acuático incluyen mercancías consideradas seguras para el comercio sin imposición de medidas sanitarias de enfermedad específica e independientemente del estatus zoosanitario del país o la zona respecto del agente patógeno considerado. En caso de existir dicha lista, los países importadores no deberán imponer restricciones comerciales a las mercancías de la lista respecto del agente patógeno considerado.

5)

Comercio de mercancías de animales acuáticos El Capítulo 5.4. describe los criterios para evaluar la inocuidad de las mercancías de animales acuáticos. Basándose en evaluaciones según los criterios del Artículo 5.4.1., en todos los capítulos de enfermedades, el punto 1 del Artículo X.X.3. contiene la lista de las mercancías de animales acuáticos que pueden ser objeto de comercio para cualquier finalidad, de un país, una zona o un compartimento no declarado libre de la enfermedad en cuestión. Los criterios de inclusión de estas mercancías en este punto 1 del Artículo X.X.3. se basan en la ausencia del agente patógeno o en su inactivación mediante tratamiento o durante el proceso de transformación.

Basándose en evaluaciones según los criterios del Artículo 5.4.2., en todos los capítulos de enfermedades, el punto 1 del Artículo X.X.12. (para el Capítulo 10.4. corresponde el Artículo 10.4.17) contiene la lista de animales acuáticos o mercancías de animales acuáticos para la venta directa al por menor para el consumo humano de un país, zona o compartimento no declarado libre de la enfermedad en cuestión. Los criterios de inclusión de estas mercancías en el punto 1 del Artículo X.X.12. toman en consideración la forma y presentación del producto, el volumen previsto de residuos de tejidos generados por el consumidor y la presencia probable del agente patógeno en los residuos.

Los capítulos de enfermedades del Código Acuático reflejan la realidad del comercio y, por ello, incluyen mercancías comercializadas teniendo en cuenta su diversidad y proponen una lista de mercancías seguras para facilitar el comercio. Los capítulos de enfermedades del Código Acuático contienen un artículo en el que se enumeran las mercancías consideradas inocuas para el comercio sin imposición de medidas sanitarias, independientemente del estatus zoosanitario del país o de la zona respecto del agente patógeno considerado. Se trata de una iniciativa en curso y algunos capítulos no contienen todavía un artículo con la lista de las mercancías inocuas. En caso de existir dicha lista, los países importadores no deberán imponer restricciones comerciales a las mercancías de la lista respecto del agente patógeno considerado.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 3 (cont.)

6)

Certificados sanitarios internacionales Un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos es un documento oficial que la Autoridad Veterinaria u otra Autoridad competente del país exportador expide de acuerdo con lo dispuesto en los Capítulos 5.1. y 5.2. Los certificados enumeran los requisitos de sanidad de los animales acuáticos que reúne la mercancía exportada. La calidad de los Servicios Veterinarios o los Servicios de Sanidad de los Animales Acuáticos del país exportador es esencial para ofrecer garantías a los socios comerciales de la seguridad sanitaria de los animales y productos acuáticos las mercancías de animales acuáticos exportadoas. Esto incluye los principios éticos de los Servicios veterinarios o los Servicios de sanidad de los animales acuáticos en cuanto a la expedición de certificados sanitarios internacionales y sus antecedentes en el cumplimiento de sus obligaciones de notificación. Los certificados sanitarios internacionales son los pilares del comercio internacional y ofrecen garantías al país importador sobre el estado sanitario de los animales y productos acuáticos las mercancías de animales acuáticos importadoas. Las medidas sanitarias prescritas deberán tener en cuenta el estatus zoosanitario tanto del país exportador como del país importador y basarse en las normas del Código acuático. Al redactar un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, deberán respetarse las pautas siguientes: a)

Enumerar las enfermedades contra las que el país importador puede protegerse legítimamente, teniendo en cuenta su propio estatus; los países importadores no deberán imponer medidas contra enfermedades que estén presentes en su territorio pero no sean objeto de un programa oficial de control o de erradicación.

b)

Para las mercancías capaces de transmitir dichas enfermedades a través del comercio internacional, el país importador deberá aplicar los artículos que traten de la mercancía considerada pertinentes en los capítulos específicos de enfermedades. La aplicación de los artículos deberá adaptarse al estatus zoosanitario del país, de la zona o del compartimento de exportación. Dicho estatus deberá determinarse de acuerdo con el Artículo 1.4.6., excepto cuando los artículos del correspondiente capítulo de enfermedad dispongan otra cosa.

c)

Al preparar certificados sanitarios internacionales aplicables a los animales acuáticos, el país importador deberá velar por emplear términos y expresiones acordes con las definiciones que constan en el glosario; como se indica en el Artículo 5.2.3., los certificados sanitarios internacionales aplicables a los animales acuáticos deberán ser lo más sencillos posible y estar claramente redactados para evitar malentendidos sobre los requisitos exigidos por el país importador.

d)

Para orientar a los Países miembros, el Capítulo 5.10. prevé modelos de certificados, que deberán utilizarse como base para expedir certificados.

67) Folleto explicativo para importadores y exportadores Se recomienda a las Autoridades Veterinarias y otras Autoridades Competentes que redacten “folletos explicativos” para ayudar a los importadores y los exportadores a entender los requisitos comerciales. Estos folletos deberán indicar y explicar las condiciones comerciales, entre otras, las medidas que deberán aplicarse antes y después de la exportación, durante el transporte y la descarga, las obligaciones legales y los trámites necesarios. En los folletos, se especificarán igualmente todos los detalles que deben figurar en los certificados sanitarios que acompañen a las remesas hasta su lugar de destino. Se recordarán también a los exportadores las reglas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo que rigen el transporte aéreo de animales acuáticos y productos de origen animal de animales acuáticos.

-------------Texto suprimido. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 4

GLOSARIO DESINFECTANTES

designa los compuestos químicos o procedimientos físicos capaces de destruir los microorganismos agentes patógenos o de detener su crecimiento o capacidad de supervivencia. DESINFECCIÓN

designa la aplicación, después de una limpieza completa, de procedimientos destinados a destruir los agentes infecciosos o parasitarios responsables de enfermedades de los animales acuáticos, incluidas las zoonosis. Esta operación se aplica a los establecimientos de acuicultura (es decir, criaderos, piscifactorías, criaderos de ostras, criaderos de camarones, viveros, etc.) y a los vehículos y objetos/equipos diversos que puedan haber sido directa o indirectamente contaminados. designa el procedimiento de limpieza y aplicación de desinfectantes para inactivar los agentes patógenos en artículos potencialmente contaminados. BIOSEGURIDAD

designa el conjunto de medidas físicas y de gestión diseñadas para reducir el riesgo de introducción, desarrollo y propagación de los agentes patógenos hacia, desde y dentro de una población de animales acuáticos. IDENTIFICACIÓN DEL PELIGRO

designa el proceso de identificación de los agentes patógenos que puede contener la mercancía que se prevé importar. PERÍODO DE INFECCIOSIDAD

designa el período más largo durante el cual un animal acuático infectado puede ser fuente de infección. ANÁLISIS DEL RIESGO

designa el proceso que comprende la identificación identificación del peligro, la evaluación del riesgo, la gestión del riesgo y la comunicación sobre el riesgo. EVALUACIÓN DEL RIESGO

designa la evaluación científica de la probabilidad y de las consecuencias biológicas y económicas de la entrada, radicación o propagación de un peligro en el territorio de un país importador.

-------------Texto suprimido.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

21 

Anexo 5

CAPÍTULO 1.1.

NOTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES Y APORTACIÓN DE DATOS EPIDEMIOLÓGICOS […]

Artículo 1.1.5. 1)

La Autoridad competente de un país en el que está ubicada una zona infectada o un compartimento infectado avisará a la Sede tan pronto como dicha zona o dicho compartimento quede libre de la enfermedad.

2)

Una zona infectada o un compartimento infectado por una enfermedad determinada podrá considerarse como tal hasta que se haya demostrado que está libre de dicha enfermedad de acuerdo con las recomendaciones del Capítulo 1.4. y de las recomendaciones pertinentes descritas en los capítulos específicos de enfermedad en los Títulos 8 a 11. libre de la misma cuando haya transcurrido, después de la declaración del último caso, un período de tiempo superior al período de infecciosidad indicado en el Código Acuático y se hayan adoptado todas las medidas de profilaxis y las medidas zoosanitarias en los animales acuáticos adecuadas para prevenir su reaparición o su propagación. La descripción detallada de estas medidas figura en los diferentes capítulos de enfermedades del Código Acuático.

3)

Podrá considerarse que un País miembro está de nuevo libre de una enfermedad determinada cuando reúna las debidas condiciones previstas en el Código acuático.

4)

La Autoridad competente de un País miembro que establezca una o varias zonas libres o un o varios compartimentos libres deberá notificarlo a la Sede facilitando los datos necesarios, entre los cuales deberán figurar los criterios sobre los que se basa el establecimiento del estatus libre y las condiciones para mantenerlo e indicando con claridad la ubicación de las zonas o los compartimentos en un mapa del territorio del País miembro. […]

-------------Texto suprimido.

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23 

Anexo 6

CAPÍTULO 1.3.

ENFERMEDADES DE LA LISTA DE LA OIE Preámbulo: las enfermedades que figuran a continuación se han inscrito en la lista de la OIE teniendo en cuenta los criterios para la inscripción de una enfermedad de los animales acuáticos (véase Artículo 1.2.2.). En caso de modificación, aprobada en la Asamblea mundial de Delegados, de esta lista de enfermedades, la nueva lista entrará en vigor el 1 de enero del año siguiente. Artículo 1.3.1. Están inscritas en la lista de la OIE las siguientes enfermedades de los peces: ‒

Herpesvirosis de la carpa koi



Infección por alfavirus de los salmónidos



Infección por Aphanomyces invadans (Síndrome ulcerante epizoótico)



Infección por Gyrodactylus salaris



Infección por las variantes con supresión en la HPR y HPR0 del virus de la anemia infecciosa del salmón



Iridovirosis de la dorada japonesa



Necrosis hematopoyética epizoótica



Necrosis hematopoyética infecciosa



Septicemia hemorrágica viral



Viremia primaveral de la carpa. Artículo 1.3.2.

Están inscritas en la lista de la OIE las siguientes enfermedades de los moluscos: ‒

Infección por Bonamia ostreae



Infección por Bonamia exitiosa



Infección por herpesvirus del abalón



Infección por Marteilia refringens



Infección por Perkinsus marinus



Infección por Perkinsus olseni



Infección por Xenohaliotis californiensis.

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24

Anexo 6 (cont.)

Artículo 1.3.3. Están inscritas en la lista de la OIE las siguientes enfermedades de los crustáceos: ‒

Enfermedad de la cola blanca



Enfermedad de las manchas blancas



Enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda



Hepatopancreatitis necrotizante



Infección por virus de la cabeza amarilla



Mionecrosis infecciosa



Necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa



Plaga del cangrejo de río (Aphanomyces astaci)



Síndrome de Taura. Artículo 1.3.4.

Están inscritas en la lista de la OIE las siguientes enfermedades de los anfibios: ‒

Infección por Batrachochytriumdendrobatidis



Infección por ranavirus.

-------------Texto suprimido.

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25 

Anexo 7

CAPÍTULO 2.1.

ANÁLISIS DEL RIESGO ASOCIADO A LAS IMPORTACIONES Artículo 2.1.1. Introducción Las importaciones de animales acuáticos y productos de animales acuáticos implican cierto riesgo de enfermedad para el país importador. Ese riesgo pueden constituirlo una enfermedad o varias enfermedades o infecciones. La principal finalidad del análisis del riesgo asociado a las importaciones es proporcionar a los países importadores un método objetivo y justificable para evaluar los riesgos de enfermedad asociados a cualquier importación de animales acuáticos, productos de animales acuáticos, material genético de animales acuáticos, alimentos para animales, productos biológicos y material patológico. Los principios y métodos que se aplican a las mercancías constituidas por animales acuáticos y a las constituidas por animales terrestres son los mismos. El análisis debe ser transparente para poder dar al país exportador una explicación clara y documentada de los motivos que justifican las condiciones impuestas a la importación o el rechazo de ésta. La transparencia también es esencial por el hecho de que los datos son a menudo inciertos o incompletos y la falta de una documentación completa puede crear confusión entre los hechos y el valor que les concede la persona que los analiza. En este capítulo se definen las recomendaciones y los principios que permiten realizar análisis de riesgos transparentes, objetivos y justificables para el comercio internacional. No se pueden dar en él detalles, sin embargo, sobre los medios que conviene utilizar para realizar un análisis del riesgo, ya que el objetivo del Código acuático es describir simplemente sus etapas fundamentales. Las etapas del análisis del riesgo que se describen en este Capítulo son la identificación del peligro, la evaluación del riesgo, la gestión del riesgo y la comunicación sobre el riesgo (Figura 1). Fig. 1. Las cuatro etapas del análisis del riesgo

La evaluación del riesgo es la etapa del análisis en que se intentan estimar los riesgos asociados a un peligro. Una evaluación del riesgo puede ser cualitativa o cuantitativa. Muchas enfermedades, en particular las que figuran en el Código acuático, que contiene normas difundidas y reconocidas internacionalmente, son objeto de un amplio consenso sobre los riesgos posibles. En estos casos es más probable que una evaluación cualitativa sea suficiente. La evaluación cualitativa no requiere competencias particulares en materia de modelización matemática y por eso se utiliza con frecuencia para las decisiones corrientes. Ningún método de evaluación del riesgo asociado a las importaciones es aplicable a todas las situaciones y, según las circunstancias, un método puede convenir más que otro.

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26

Anexo 7 (cont.)

En el proceso de análisis del riesgo asociado a las importaciones de animales acuáticos y productos de animales acuáticos suele ser necesario tener en cuenta los resultados de una evaluación de los Servicios de sanidad de los animales acuáticos, la zonificación y la compartimentación, así como los sistemas de vigilancia utilizados en el país exportador para el seguimiento de las enfermedades de los animales acuáticos. Estos aspectos se describen en otros capítulos del Código acuático.

Artículo 2.1.2. Identificación del peligro La identificación del peligro consiste en identificar los agentes patógenos que podrían producir efectos perjudiciales al importar una mercancía. Los peligros posibles que se identifiquen serán, en principio, los que corresponden a la especie animal que se prevé importar, o de la que deriva la mercancía, y que pueden estar presentes en el país exportador. Será necesario identificar, por consiguiente, si cada peligro potencial existe ya en el país importador y si se trata de una enfermedad de la lista de la OIE o sujeta a control o erradicación, y asegurarse de que las medidas impuestas a la importación no son más restrictivas para el comercio que las que se aplican en el país. La identificación del peligro es una etapa de clasificación en la que se identifican dicotómicamente los agentes biológicos como peligros potenciales o no. La evaluación del riesgo debe concluir en esta etapa si no se identifica ningún peligro potencial asociado a la importación prevista. Las evaluaciones de los Servicios de sanidad de los animales acuáticos, de los programas de vigilancia y control y de los sistemas de zonificación y compartimentación son elementos importantes para evaluar la probabilidad de presencia de peligros en la población de animales acuáticos del país exportador. Un país importador también puede autorizar la importación basándose en las normas sanitarias pertinentes recomendadas por el Código acuático y no tendrá entonces necesidad de proceder a una evaluación del riesgo.

Artículo 2.1.3. Principios de la evaluación del riesgo 1)

La evaluación del riesgo debe ser flexible para adaptarse a la complejidad de las situaciones reales. No existe ningún método que se aplique a todos los casos. La evaluación del riesgo debe poder tener en cuenta la variedad de mercancías que constituyen los animales acuáticos, los múltiples peligros que se pueden identificar en una importación y la especificidad de cada enfermedad, así como los sistemas de detección y vigilancia, las condiciones de exposición y los tipos y cantidades de datos y de información.

2)

Son válidos tanto el método de evaluación cualitativa como el de evaluación cuantitativa del riesgo.

3)

La evaluación del riesgo debe basarse en la información científica disponible más actualizada. Debe estar debidamente documentada y sustentada por referencias a publicaciones científicas y a otras fuentes, incluida la opinión de expertos.

4)

La coherencia y la transparencia de los métodos de evaluación del riesgo son esenciales para garantizar la imparcialidad y racionalidad de la evaluación, la coherencia de las decisiones y la facilidad de comprensión por todas las partes interesadas.

5)

Las evaluaciones del riesgo deben dar cuenta de las incertidumbres y las hipótesis formuladas, así como de su influencia en el resultado final.

6)

El riesgo es mayor cuanto mayor es la cantidad de mercancías importadas.

7)

Debe ser posible actualizar la evaluación del riesgo en caso de que se obtenga información complementaria.

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27 

Anexo 7 (cont.)

Artículo 2.1.4. Etapas de la evaluación del riesgo 1.

Evaluación del riesgo de introducción La evaluación del riesgo de introducción consiste en describir el(los) proceso(s) biológico(s) necesario(s) para que una actividad de importación provoque la introducción de un agente patógeno en un medio determinado, y en estimar la probabilidad de que se desarrolle el proceso completo, o bien cualitativamente (en forma de texto) o bien cuantitativamente (en forma de estimación numérica). La evaluación del riesgo de introducción describe la probabilidad de introducción de cada uno de los posibles peligros (los agentes patógenos) en cada circunstancia, en función de las cantidades y del momento, así como los cambios que pueden resultar de diversas acciones, circunstancias o medidas. Entre los parámetros que pueden ser necesarios para la evaluación del riesgo de la introducción, cabe citar: a)

b)

c)

Factores biológicos –

Especie, cepa o genotipo y edad del animal acuático,



cepa del agente,



tejidos en que se produce la infección y/o la contaminación,



eficacia de la vacunación, de las pruebas de diagnóstico, del tratamiento y de la cuarentena.

Factores relacionados con el país –

Incidencia/prevalencia,



evaluación de los Servicios de sanidad de los animales acuáticos, de los programas de vigilancia y control y de los sistemas de zonificación y compartimentación del país exportador.

Factores relacionados con la mercancía –

Estado de la mercancía (viva o muerta),



cantidad de mercancía que se prevé importar,



facilidad de contaminación por el agente,



efecto de los procedimientos de transformación en el agente patógeno presente en la mercancía,



efecto del almacenamiento y del transporte en el agente patógeno presente en la mercancía.

Si la evaluación del riesgo de introducción no pone de manifiesto ningún riesgo significativo, la evaluación del riesgo concluye ahí.

2.

Evaluación de la exposición La evaluación de la exposición consiste en describir el(los) proceso(s) biológico(s) necesario(s) para que los animales y las personas del país importador se vean expuestos a los peligros (en este caso a los agentes patógenos) de una fuente de riesgo determinada, y en estimar la probabilidad de advenimiento de esa exposición, o bien cualitativamente (en forma de texto) o bien cuantitativamente (en forma de estimación numérica).

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Anexo 7 (cont.)

La probabilidad de exposición a los peligros identificados se estima con relación a determinadas condiciones de exposición, en función de las cantidades, el momento, la frecuencia, la duración de la exposición, las vías de exposición y del número, la especie y otras características de la población animal y humana expuesta a los peligros. Entre los parámetros necesarios para la evaluación de la exposición, cabe citar: a)

b)

c)

Factores biológicos –

Propiedades del agente patógeno (virulencia, patogenicidad y parámetros de supervivencia),



genotipo del huésped.

Factores relacionados con el país –

Presencia de posibles vectores o huéspedes intermediarios,



demografía de los animales acuáticos (presencia de especies susceptibles o reservorio conocidas y distribución de las mismas),



demografía humana y de los animales terrestres (posible presencia de buitres o de aves piscívoras),



usos y costumbres,



características geográficas y medioambientales (datos hidrográficos, variaciones de temperatura, corrientes de agua).

Factores relacionados con la mercancía –

Estado de la mercancía (viva o muerta),



cantidad de mercancía que se prevé importar,



uso previsto de los animales acuáticos o productos de animales acuáticos importados (consumo nacional, repoblación, incorporación a los alimentos para animales o utilización como cebo),



métodos de eliminación de los despojos.

Si la evaluación de la exposición no pone de manifiesto ningún riesgo significativo, la evaluación del riesgo puede concluir ahí.

3.

Evaluación de las consecuencias La evaluación de las consecuencias consiste en describir la relación existente entre las exposiciones especificadas a un agente biológico y las consecuencias de estas exposiciones. Debe existir una causa por la que las exposiciones tienen consecuencias sanitarias o medioambientales perjudiciales, que a su vez pueden comportar consecuencias socioeconómicas. La evaluación de las consecuencias describe las posibles consecuencias de una exposición dada y realiza una estimación de la probabilidad de que se produzcan. Esta estimación puede ser o bien cualitativa (en forma de texto) o bien cuantitativa (en forma de estimación numérica). Entre las consecuencias, cabe citar: a)

Consecuencias directas –

Pérdidas de producción y cierre de empresas por infección o enfermedad de los animales acuáticos,



consecuencias para la salud pública.

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Anexo 7 (cont.)

b)

4.

Consecuencias indirectas –

Gastos de vigilancia y control,



gastos de indemnización,



pérdidas de posibles operaciones comerciales.



consecuencias adversas, y posiblemente irreversibles, para el medioambiente.

Estimación del riesgo La estimación del riesgo consiste en sumar los resultados de la evaluación del riesgo de introducción, la evaluación de la exposición y la evaluación de las consecuencias para medir todos los riesgos asociados a los peligros identificados al principio. Así pues, la estimación del riesgo toma en cuenta todo el proceso de materialización de un riesgo, desde el peligro identificado hasta el efecto indeseable. Los resultados finales de una evaluación cuantitativa pueden incluir: –

una evaluación de las poblaciones de animales acuáticos y/o una estimación del número de establecimientos de acuicultura o de personas que pueden tener problemas de salud más o menos graves a lo largo del tiempo;



las distribuciones de probabilidades, los intervalos de confianza y otros medios de expresión de la incertidumbre en este tipo de estimaciones;



la representación de la variancia de todos los parámetros iniciales del modelo;



un análisis de sensibilidad para clasificar los parámetros en función de su contribución a la variancia de los resultados de la estimación del riesgo;



el análisis de la interdependencia y correlación de los parámetros.

Artículo 2.1.5. Principios de la gestión del riesgo 1)

La gestión del riesgo es el proceso que consiste en decidir y aplicar medidas para hacer frente a los riesgos identificados en la evaluación del riesgo que permiten alcanzar el nivel de protección que el País miembro considera apropiado, y en asegurarse al mismo tiempo de que los efectos negativos de esas medidas en el comercio son mínimos. El objetivo es llegar a establecer el equilibrio entre la voluntad de un país de reducir al mínimo la probabilidad o la frecuencia de introducción de enfermedades, así como de sus consecuencias, y su deseo de importar mercancías y de cumplir con las obligaciones impuestas por los acuerdos sobre comercio internacional.

2)

Las normas internacionales de la OIE son las medidas sanitarias recomendadas para la gestión del riesgo. La aplicación de estas medidas sanitarias debe atenerse a los objetivos de las normas.

Artículo 2.1.6. Componentes de la gestión del riesgo 1)

Apreciación del riesgo - el proceso que consiste en comparar el nivel de riesgo estimado por la evaluación del riesgo con la reducción del riesgo que se espera de las medidas de gestión del riesgo propuestas con el nivel de protección considerado apropiado por el País miembro.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

30

Anexo 7 (cont.)

2)

Evaluación de las opciones - el proceso que consiste en identificar, evaluar en términos de eficacia y factibilidad y seleccionar medidas sanitarias para reducir el riesgo asociado a una importación con el fin de adaptarse al nivel de protección considerado apropiado por el País miembro. La eficacia de una opción es el grado en que ésta reduce la probabilidad o la magnitud de las consecuencias sanitarias y económicas perjudiciales. La evaluación de la eficacia de las opciones seleccionadas es un proceso iterativo que implica la inclusión de esas opciones en la evaluación del riesgo y la posterior comparación del nivel de riesgo obtenido con el que se considera aceptable. La evaluación de la factibilidad se concentra normalmente en factores técnicos, operativos y económicos relacionados con la aplicación de las opciones de gestión del riesgo.

3)

Aplicación - el proceso que consiste en llevar a cabo la decisión de gestión del riesgo y en velar por la aplicación de las medidas prescritas.

4)

Control continuo y revisión - el proceso ininterrumpido por el que se verifican continuamente las medidas de gestión del riesgo para asegurarse de que están dando los resultados esperados.

Artículo 2.1.7. Principios de la información sobre el riesgo 1)

La comunicación sobre el riesgo es el proceso por el que se recaba información y opiniones de partes potencialmente afectadas o interesadas acerca de los peligros y riesgos durante un análisis de riesgos, y por el que se comunican los resultados de la evaluación del riesgo y se proponen medidas de gestión del riesgo a quienes toman las decisiones y a las partes interesadas del país importador y del país exportador. Es un proceso multidimensional e iterativo que debería comenzar al principio del análisis de riesgos y continuar hasta el final.

2)

Cada vez que se emprende un análisis de riesgos debe definirse una estrategia de comunicación sobre el riesgo.

3)

La comunicación sobre el riesgo debe ser un intercambio de información abierto, interactivo, iterativo y transparente que puede prolongarse después de la decisión sobre la importación.

4)

Los principales participantes en la comunicación sobre el riesgo son las autoridades del país exportador y otras partes interesadas, como los acuicultores nacionales, los pescadores aficionados y profesionales, las asociaciones de protección de la fauna silvestre, las asociaciones de consumidores y los grupos industriales nacionales y extranjeros.

5)

Las hipótesis y la incertidumbre del modelo y de los parámetros iniciales, así como los resultados de la evaluación del riesgo, deben formar parte de la información.

6)

La comunicación sobre el riesgo debe ser sometida a una revisión por pares, a fin de obtener a una crítica científica y garantizar que los datos, la información, los métodos y las hipótesis son los mejores posibles.

-------------Texto suprimido. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

31 

Anexo 8

CAPÍTULO 4.X.

RECOMENDACIONES PARA LA DESINFECCIÓN DE LA SUPERFICIE DE HUEVOS DE SALMÓNIDOS Artículo 4.X.1. Introducción La práctica de desinfección de los huevos de salmónidos en los criaderos resulta fundamental para garantizar que las enfermedades endémicas no se transfieran a incubadoras con huevos ni entre instalaciones, y forma parte integrante de los protocolos de higiene normales de los criaderos. El proceso de desinfección también es importante cuando se comercializan huevos de salmónidos entre compartimentos, zonas o países para prevenir la transferencia de algunos agentes patógenos. Si bien el uso de desinfectantes suele ser eficaz para la desinfección de la superficie del huevo y de los fluidos de reproducción, no previene la transmisión vertical. Los huevos de salmónidos se pueden desinfectar utilizando un cierto número de agentes químicos; sin embargo, el método más comúnmente utilizado es la desinfección con povidona yodada, un producto a base de yodo. Se deberán aplicar distintos protocolos según la etapa de desarrollo del huevo. Los iodóforos se usan comúnmente como desinfectantes para tratar los huevos de salmónidos. Tienen la ventaja de suministrar un pH neutro, no ser irritantes y ser poco tóxicos. El pH neutro es importante para minimizar la toxicidad y lograr una mayor eficacia. Los iodóforos más utilizados son las soluciones de povidona yodada, por su baja toxicidad y pH neutro en la mayoría de las circunstancias. Si se utilizan otros agentes con contenido de yodo para la desinfección, es esencial que hayan sido adecuadamente tamponados. Artículo 4.X.2. Protocolo de desinfección para los huevos de salmónidos Este protocolo de desinfección se puede aplicar a los huevos de salmónidos recientemente fertilizados o embrionados. Sin embargo, los huevos recientemente fertilizados deben haber iniciado su endurecimiento antes de someterse al protocolo de desinfección. Si bien existe un margen de seguridad considerable para los huevos endurecidos, el protocolo de desinfección no se recomienda para los óvulos no fertilizados o durante la fertilización. Es esencial que el pH de la solución yodada se mantenga entre 6 y 8. Los huevos de salmónidos deberán someterse al siguiente protocolo de desinfección: 1)

enjuague con una solución salina al 0,9% (30–60 segundos) para quitar los restos orgánicos;

2)

inmersión en una solución yodada de 100 ppm de yodo disponible durante un mínimo de 10 minutos. La solución yodada se debe utilizar sólo una vez. La proporción de huevos respecto a la solución yodada deberá ser como mínimo de 1:4;

3)

nuevo enjuague en una solución salina al 0,9% durante 30–60 segundos;

4)

mantenimiento en agua libre de agentes patógenos.

Las soluciones podrán tamponarse con 100 mg de bicarbonato de sodio (NaHCO3) por litro de solución yodada si el pH es bajo.

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33 

Anexo 9

CAPÍTULO 4.7.

CONTROL DE LOS AGENTES PATÓGENOS EN LOS ALIMENTOS PARA ANIMALES ACUÁTICOS Artículo 4.7.1. Introducción Los alimentos para animales (o piensos) pueden representar una fuente de enfermedades infecciosas en los animales acuáticos. Dado que, a menudo, los animales acuáticos son uno de los principales ingredientes de alimentos para los propios animales acuáticos, y que el uso de alimentos o piensos semielaborados o sin elaborar constituye una práctica común, es necesario examinar el riesgo de transmisión de enfermedad a través de los alimentos. Artículo 4.7.2. Ámbito de aplicación El propósito de este capítulo es tratar la transmisión de enfermedades infecciosas de los animales acuáticos a través de los alimentos para prevenir la entrada y la propagación en un país, zona o compartimento libre de los agentes patógenos causantes de tales enfermedades. Este capítulo se aplica a la elaboración y el uso de todos los productos destinados a los alimentos y a los ingredientes de alimentos, ya sea que se produzcan en la explotación o con fines comerciales. Los principios del análisis del riesgo (de acuerdo con el Capítulo 2.1.) deberán aplicarse para determinar los riesgos asociados a la producción y el uso de alimentos en los animales acuáticos. Este capítulo complementa las orientaciones establecidas por el Código de Prácticas del Codex sobre Buena Alimentación Animal (CAC/RCP 54-2004). Artículo 4.7.3. Responsabilidades La Autoridad competente tiene la responsabilidad de establecer y hacer cumplir los requisitos reglamentarios relacionados con la alimentación animal, y verificar el cumplimiento de dichos requisitos. Asimismo, ha de aumentar el conocimiento de los riesgos relacionados con el uso en la acuicultura de alimentos semielaborados y no elaborados. Los productores de alimentos tienen la responsabilidad de garantizar que su producción cumpla con los requisitos reglamentarios. Se deberán establecer registros y planes de urgencia para determinar el origen de los productos que no sean conformes, poder retirarlos o destruirlos. Todo el personal que intervenga en la cría, la fabricación, el transporte, el almacenamiento y la manipulación de alimentos e ingredientes de alimentos deberá estar debidamente capacitado y ser consciente de su función y su responsabilidad en la prevención de la introducción o la propagación de enfermedades infecciosas de los animales acuáticos. Los equipos destinados a la producción, almacenamiento y transporte de los alimentos y los ingredientes de alimentos deberán mantenerse limpios y en funcionamiento. Los propietarios y responsables de la gestión de los establecimientos de acuicultura deberán respetar los requisitos reglamentarios e implementar programas sanitarios en sus granjas para enfrentar los riesgos relacionados con el uso de alimentos semielaborados y no elaborados. Esto se puede llevar a cabo a través de registros que indiquen la fuente de los alimentos con fines de trazabilidad, implementación de medidas de mitigación del riesgo en la explotación y detección temprana de enfermedades infecciosas. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

34

Anexo 9 (cont.) Se podrá requerir que los veterinarios del sector privado y otros profesionales de sanidad para los animales acuáticos que brindan servicios especializados a los productores y a la industria de los alimentos cumplan con los requisitos reglamentarios asociados a los servicios que suministran (por ejemplo, notificación de enfermedades, normas de calidad y transparencia). Artículo 4.7.4. Peligros asociados con la alimentación de los animales acuáticos Los peligros biológicos asociados a los alimentos e ingredientes de alimentos incluyen agentes patógenos como bacterias, virus, hongos y parásitos. El alcance de estas recomendaciones abarca las enfermedades de la lista de la OIE y otros agentes patógenos que causan un efecto adverso en la sanidad de los animales acuáticos. Los peligros químicos y físicos asociados con los alimentos y los ingredientes de alimentos no figuran en este capítulo. La resistencia a los antimicrobianos derivada del uso de agentes antimicrobianos en los alimentos se trata en el Título 6. Artículo 4.7.5. Vías de riesgo y exposición Los alimentos para animales pueden contaminarse por agentes patógenos presentes en el momento de la producción, transporte, almacenamiento y procesamiento de mercancías utilizadas como ingredientes de alimentos. La contaminación también puede ocurrir durante su fabricación, transporte, almacenamiento y uso. Las prácticas de higiene deficientes durante el procesamiento y la fabricación, el transporte y almacenamiento constituyen fuentes potenciales de contaminación por agentes patógenos. Los animales acuáticos pueden estar expuestos directamente a los agentes patógenos presentes en los alimentos para animales. Los animales acuáticos también pueden estar expuestos indirectamente a través de la contaminación del entorno por los alimentos. Artículo 4.7.6. Gestión del riesgo 1.

Uso de los alimentos y de los ingredientes de alimentos provenientes de cualquier tipo de fuente Algunas mercancías son objeto de un procesamiento significativo como tratamiento térmico, acidificación, extrusión y extracción. Existe un riesgo insignificante de que los agentes patógenos sobrevivan en los productos que se han preparado respetando las Buenas Prácticas de Fabricación. Los criterios indicados en el Capítulo 5.4. se pueden utilizar para evaluar la seguridad de las mercancías que servirán de base a los ingredientes de alimentos. El Artículo X.X.3. de todos los capítulos sobre enfermedades específicas de los Títulos 8 a 11 enumeran las mercancías consideradas como seguras para cualquier finalidad, incluyendo el uso como alimento para animales o ingrediente de alimentos. Las Autoridades competentes también deberán conocer el origen de los alimentos e ingredientes de alimentos de un país, zona o compartimento libre de un determinado agente patógeno.

2.

Uso de alimentos para animales e ingredientes de alimentos cuyo lugar de origen puede no estar libre de un determinado agente patógeno Al utilizar alimentos para animales e ingredientes de alimentos cuyo origen puede no estar libre de determinados agentes patógenos, las Autoridades competentes deberán aplicar las siguientes medidas de mitigación del riesgo: a)

tratamiento (por ejemplo, térmico o acidificación) de la mercancía utilizando un método aprobado por la Autoridad competente para inactivar el o los agentes patógenos como indicado en los artículos X.X.10. (para el Capítulo 10.4. consultar el Artículo 10.4.17.) de todos los capítulos sobre enfermedades en los Títulos 8 a 11; o Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

35 

Anexo 9 (cont.)

3.

b)

confirmación (por ejemplo, mediante pruebas) de que los agentes patógenos no están presentes en la mercancía; o

c)

uso de los alimentos para animales sólo en poblaciones que no son susceptibles al o los agentes patógenos en cuestión y cuando las especies susceptibles no entren en contacto con los alimentos o los residuos de los mismos.

Producción de alimentos

Para prevenir la contaminación por agentes patógenos durante el procesamiento, la fabricación, el almacenamiento y el transporte de alimentos para animales e ingredientes de alimentos, se recomienda que:

a)

se efectúe una limpieza con chorro de agua, secuenciación o limpieza en vacío de las líneas de producción y las instalaciones de almacenamiento entre cada lote cuando corresponda;

b)

se construyan los edificios y equipos destinados al procesamiento y el transporte de alimentos e ingredientes de alimentos de forma que se faciliten las operaciones de higiene, mantenimiento y limpieza y se prevenga la contaminación;

c)

se diseñen y organicen las plantas de fabricación de alimentos de manera que se evite la contaminación cruzada entre lotes;

d)

se almacenen los alimentos e ingredientes de alimentos procesados por separado de los ingredientes de alimentos sin procesar;

e)

se mantengan limpios los alimentos y los ingredientes de alimentos, las instalaciones de almacenamiento y su entorno inmediato;

f)

se apliquen medidas para inactivar los agentes patógenos, como el tratamiento térmico, si es necesario;

g)

se coloquen etiquetas para la identificación de los alimentos e ingredientes de alimentos en el lote, con el lugar y la fecha de fabricación para permitir la trazabilidad de los alimentos e ingredientes de alimentos.

 

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

37 

Anexo 10

CAPÍTULO 5.1.

OBLIGACIONES GENERALES EN MATERIA DE CERTIFICACIÓN Artículo 5.1.1. Se debe tomar en cuenta un conjunto de factores para facilitar el comercio internacional de animales acuáticos y productos de animales acuáticos, sin que ello implique riesgos inaceptables para la salud pública y para la salud de los animales acuáticos. Dada la diferencia de situaciones zoosanitarias entre países, el Código acuático propone diversas opciones. Antes de determinar las condiciones para el comercio, se debe considerar la situación zoosanitaria del país exportador, del o de los países de tránsito y del país importador. Para armonizar en la mayor medida posible los aspectos del comercio internacional relativos a la salud de los animales acuáticos, las Autoridades competentes de los Países miembros deben basar sus condiciones para la importación en las normas de la OIE. Dichas condiciones deben figurar en certificados redactados según los modelos de certificados sanitarios internacionales aplicables a los animales acuáticos que figuran en el Capítulo 5.11. Las condiciones estipuladas deberán ser precisas y concisas y expresar claramente las condiciones del país importador. Para ello será necesaria una concertación previa entre las Autoridades competentes de los países importadores y exportadores que contribuirá a determinar los requisitos concretos de la certificación. Los certificados deberán expedirse y firmarse por un único certificador oficial competente, autorizado por la Autoridad competente para llevar a cabo inspecciones, y deberán ratificarse mediante la firma o el sello oficial de la Autoridad competente. Los requisitos de certificación no deberán incluir condiciones de enfermedades que no se transmitan por el producto en cuestión. El certificado deberá firmarse de conformidad con lo dispuesto en el Capítulo 5.2. Si los representantes de una Autoridad competente desean visitar otro país por motivos profesionales que interesan a la Autoridad competente de ese otro país, esta última deberá ser informada de la visita. Conviene prever de antemano la visita según el acuerdo suscrito entre las Autoridades competentes interesadas. Artículo 5.1.2. Responsabilidades del país importador 1) Las condiciones de importación que figuran en el certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos deben garantizar que las mercancías introducidas en el país importador cumplen las normas de la OIE. Los países importadores deberán limitar sus requisitos a aquellos que son necesarios para alcanzar un nivel de protección nacional adecuado. En el caso de que éstas sean más estrictas que las normas de la OIE, deberán basarse en un análisis del riesgo asociado a la importación. Los requisitos de importación que figuran en el certificado veterinario internacional deberán garantizar que las mercancías introducidas en el país importador cumplen las normas de la OIE. Los países importadores deberán adaptarlimitar sus requisitos a aquellos recomendados en las normas pertinentes de la OIE que sean necesarios para alcanzar el nivel de protección nacional adecuado. Si tal norma no existe o si el país elige un nivel de protección que requiere medidas Si éstos son más estrictoas que las normas de la OIE, las mismas deberán basarse en un análisis del riesgo asociado a la importación. 2) Entre los requisitos exigidos en el certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos no deberá figurar el de ausencia de agentes patógenos o enfermedades de los animales acuáticos que estén presentes en el territorio del país importador y no sean objeto de un programa oficial de control, salvo cuando la patogenicidad de la cepa en el país exportador es muy superior o si su gama de hospedadores es muy amplia, o en ambos casos. Las medidas impuestas a las importaciones para la gestión de los riesgos asociados a determinado agente patógeno o a determinada enfermedad no deben exigir un nivel de protección superior al que confieren las medidas del programa oficial de control que se aplica en el país importador. Las medidas impuestas a las importaciones para la gestión de los riesgos asociados a determinado agente patógeno o a determinada enfermedad no deben ser más estrictas exigir un nivel de protección superior al que aquellas que se aplican como parte del confieren las medidas del programa oficial de control que se aplica en del país importador. 3) El certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos no incluirá medidas contra agentes patógenos o enfermedades que no figuren en la lista de la OIE, a no ser que el país importador haya demostrado que el agente patógeno o la enfermedad entraña un riesgo significativo para este país, tras realizar un análisis de riesgos de las importaciones, de conformidad con el Título 2. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 10 (cont.)

4)

La transmisión por parte de la Autoridad competente del país importador de requisitos o certificados de importación o la comunicación de las condiciones exigidas en materia de importación a personas que no sean la Autoridad competente de otro país exigirá que se envíen también copias de los referidos documentos a la Autoridad competente del país exportador. Con esta importante norma se evitarán los retrasos y dificultades que pueden surgir entre los negociantes y las Autoridades competentes cuando no está establecida la autenticidad de los certificados o de las licencias. La responsabilidad de esta información suele incumbir a las Autoridades competentes del país exportador; podrá, sin embargo, incumbir a veterinarios del sector privado de los lugares de origen de las mercancías, siempre y cuando se haya obtenido la aprobación y autentificación de las Autoridades competentes.

5)

Puede ocurrir que cambie el destinatario, la identificación del medio de transporte o el puesto fronterizo después de haber expedido el certificado. Por ser cambios que no modifican el estado sanitario de la remesa, ninguno de ellos deberá impedir que se acepte el certificado. Artículo 5.1.3.

Responsabilidades del país exportador 1)

2)

3)

Cualquier país exportador deberá estar dispuesto a facilitar al país importador, siempre que éste lo solicite, datos sobre: a)

su situación zoosanitaria y sus sistemas nacionales de información sobre enfermedades de los animales acuáticos, con el fin de determinar si está libre o dispone de zonas libres o compartimentos libres de las enfermedades de la lista de la OIE, y sobre el método seguido para lograr la ausencia de enfermedad, por ejemplo, ausencia histórica o ausencia de especies susceptibles o de vigilancia específica, así como sobre la regulación y los procedimientos vigentes para mantener esa situación;

b)

la aparición de enfermedades de la lista de la OIE, que deberá comunicar con regularidad y rapidez;

c)

su capacidad para aplicar medidas de prevención y control de las enfermedades de la lista de la OIE;

d)

la estructura de la Autoridad competente y los poderes de que ésta dispone;

e)

las técnicas que utiliza, y en particular sobre las pruebas biológicas y las vacunas utilizadas en la totalidad o parte de su territorio.

Las Autoridades competentes de los países exportadores deberán: a)

disponer de procedimientos oficiales de autorización de los certificadores oficiales que definan sus funciones y deberes, así como las condiciones de supervisión y responsabilización, incluida la posibilidad de ser privados temporal o definitivamente de autorización;

b)

asegurarse de que los certificadores oficiales reciben las instrucciones y la formación necesarias;

c)

vigilar la actividad de los certificadores oficiales para comprobar su integridad y su imparcialidad.

La Autoridad competente del país exportador es responsable en última instancia del certificado utilizado en una operación de comercio internacional Artículo 5.1.4.

Responsabilidades en caso de incidente relacionado con una importación 1)

El comercio internacional implica una responsabilidad ética permanente. Por consiguiente, si dentro de un periodo razonable con posterioridad a una exportación, la Autoridad competente tiene conocimiento de que ha aparecido o reaparecido una enfermedad expresamente mencionada en el certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, o cualquier otra enfermedad que revista importancia epidemiológica para el país importador, dicha Autoridad competente tendrá la obligación de notificar el caso al país importador, para que las mercancías importadas puedan ser inspeccionados o sometidos a pruebas y se adopten las medidas pertinentes para limitar la propagación de la enfermedad si ha sido introducida inadvertidamente.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 10 (cont.) 2)

En caso de aparición de una enfermedad en animales acuáticos importados, dentro de un período razonable posterior a la importación, la Autoridad competente del país exportador deberá ser informada para que pueda realizar una investigación, ya que puede tratarse de la primera información disponible sobre la presencia de la enfermedad en una población de animales acuáticos anteriormente libre de ella. La Autoridad competente del país importador deberá ser informada del resultado de la investigación, pues puede que el origen de la infección no esté en el país exportador.

3)

En caso de sospecha, razonablemente fundada, de que un certificado oficial sea fraudulento, las Autoridades competentes del país importador y del país exportador deberán proceder a una investigación. Deberán considerar también la necesidad de notificar el hecho a terceros países que puedan verse afectados. Todos los lotes asociados a la sospecha deberán mantenerse bajo control oficial, en espera del resultado de la investigación. Las Autoridades competentes de todos los países interesados deberán cooperar plenamente con la investigación. Si se demuestra que el certificado es fraudulento, se hará todo lo posible por identificar a los responsables y tomar las medidas apropiadas en virtud de la legislación pertinente.

4)

En caso de que se tengan motivos para sospechar la falsificación de un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, las Autoridades competentes del país importador y del país exportador procederán a una investigación. También se notificará la sospecha a cualquier tercer país concernido. Todas las remesas relacionadas con el certificado deberán permanecer bajo control oficial hasta que se conozca el resultado de la investigación. Las Autoridades competentes de todos los países concernidos deberán colaborar en la investigación. Si el certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos resulta ser falso, se hará todo lo posible por identificar a los responsables y tomar las medidas previstas por la legislación pertinente.

-------------Texto suprimido.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

41 

Anexo 11

CAPÍTULO 5.2.

PROCEDIMIENTOS DE CERTIFICACIÓN Artículo 5.2.1. Protección de la integridad profesional de los certificadores oficiales La certificación deberá basarse en normas éticas rigurosas, la principal de las cuales será el respeto y amparo de la integridad profesional del certificador oficial. Será fundamental incluir en el certificado únicamente aquellos requisitos específicos que puedan ser reconocidos con precisión y plena conciencia por un certificador oficial. No deberá exigirse, por ejemplo, que se certifique que una zona está libre de enfermedades que no son de declaración obligatoria en el país importador y de cuya existencia el certificador oficial firmante no está necesariamente informado. Será inaceptable exigir que se certifiquen hechos que tendrán lugar después de la firma del documento y que, por lo tanto, no están bajo el control ni la inspección directa del certificador oficial firmante. Artículo 5.2.2. Certificadores oficiales Los certificadores oficiales deberán: 1)

estar autorizados por la Autoridad competente del país exportador para firmar los certificados sanitarios internacionales aplicables a los animales acuáticos;

2)

certificar exclusivamente hechos de los que tengan conocimiento en el momento de firmar el certificado o de los que haya dado testimonio otra persona competente autorizada por la Autoridad competente;

3)

firmar solamente en el momento oportuno certificados que estén correcta y completamente cumplimentados; cuando los certificadores oficiales firmen un certificado a partir de otros justificantes, deberán haber comprobado o poseer los justificantes antes de firmar el certificado;

4)

no tener ningún conflicto de intereses con los aspectos comerciales vinculados a los animales acuáticos o productos de animales acuáticos objeto del certificado y ser independientes de las partes comerciales interesadas. Artículo 5.2.3.

Preparación de los certificados sanitarios internacionales aplicables a los animales acuáticos Los certificados se establecerán de conformidad con los principios siguientes: 1)

Los certificados se diseñarán de forma que reduzca al mínimo la posibilidad de falsificarlos, lo que implica dotarlos de un número de identificación exclusivo y utilizar otros medios de seguridad apropiados. Los certificados impresos en papel deberán llevar la firma del certificador oficial y el sello oficial de identificación de la Autoridad competente que los expide. En el caso de certificados de varias páginas, cada página deberá llevar el número exclusivo del certificado y el número de página correspondiente. Los procedimientos de certificación electrónica deberán incluir garantías equivalentes.

2)

Los certificados deberán redactarse utilizando términos sencillos, claros y lo más comprensibles posible, sin dejar de tener por ello fuerza legal.

3)

Los certificados deberán estar escritos en el idioma del país importador, si éste lo solicita. En ese caso deberán estar escritos también en un idioma que comprenda el certificador oficial.

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Anexo 11 (cont.)

4)

Los certificados deberán prever la mención de una identificación apropiada de los animales acuáticos y productos de animales acuáticos, salvo si esa operación es irrealizable (huevos embrionados, por ejemplo).

5)

Los certificados no deberán prever la certificación de hechos que un certificador oficial desconozca o no pueda comprobar y confirmar.

6)

Los certificados deberán ser entregados al certificador oficial acompañados, si procede, de notas de instrucciones sobre las investigaciones, los exámenes y las pruebas que es preciso realizar antes de firmar el certificado.

7)

El texto de un certificado no deberá ser enmendado, excepto por tachaduras, las cuales deberán ser selladas y firmadas por el certificador oficial.

8)

La firma y el sello deberán ser de un color distinto del utilizado para imprimir el certificado. El sello podrá ser en relieve en lugar de tener un color diferente.

9)

Sólo se aceptarán los certificados originales por el país importador.

10) La Autoridad competente podrá expedir certificados de sustitución para reemplazar certificados que se hayan perdido, deteriorado, contengan errores o en los que figuren datos que ya no sean correctos, por ejemplo. Estos certificados deberán llevar una marca que indique claramente que son certificados de sustitución. En ellos deberá figurar el número y la fecha de expedición del certificado original. El certificado original se anulará y, si fuere posible, se devolverá a la autoridad que lo ha expedido. Artículo 5.2.4. Certificación electrónica 1)

Los certificados podrán presentarse en forma de documentos electrónicos intercambio de datos enviados directamente por la Autoridad competente del país exportador a la del país importador. a)

Los sistemas que proporcionan certificados electrónicos suelen poseer una interfaz con las empresas que comercializan las mercancías para que esas empresas suministren información a la autoridad encargada de la certificación. El certificador oficial deberá tener acceso a toda la información que juzgue necesaria, como el origen de los animales acuáticos y los resultados de laboratorio.

b)

Al intercambiar certificados electrónicos y con el fin de utilizar plenamente el intercambio de datos electrónicos, las Autoridades competentes deberán emplear el lenguaje, la estructura de mensaje y los protocolos de intercambio normalizados internacionalmente. El Centro de las Naciones Unidas de Facilitación del Comercio y de las Transacciones Electrónicas (CEFACT-ONU) proporciona directrices para la certificación electrónica en el lenguaje extensible de marcas (sistemas XML) normalizado del Consorcio World Wide Web (W3C), así como mecanismos de intercambio seguro entre Autoridades competentes.

c)

Un método seguro de intercambio electrónico de datos deberá garantizar la autentificación digital de los certificados, la codificación, los mecanismos de rechazo, el control y la verificación del acceso y cortafuegos.

2)

Los certificados electrónicos deberán contener la misma información que los certificados convencionales.

3)

La Autoridad competente deberá establecer sistemas de seguridad que impidan el acceso de personas u organizaciones no autorizadas a los certificados electrónicos.

4)

El certificador oficial deberá asumir oficialmente la responsabilidad de proteger su firma electrónica.

-------------Texto suprimido. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

43 

Anexo 12

CAPÍTULO 6.5.

ANÁLISIS DEL RIESGO ASOCIADO A LA RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS COMO CONSECUENCIA DE SU USO EN ANIMALES ACUÁTICOS Artículo 6.5.1. Recomendaciones para analizar los riesgos para la salud humana y la sanidad de los animales acuáticos que entrañan los microorganismos de origen animal resistentes a los agentes antimicrobianos 1.

Introducción La resistencia a los agentes antimicrobianos es un fenómeno que se produce naturalmente y que está influenciado por muchos factores. No obstante, la principal causa para la selección y diseminación de microorganismos resistentes es la utilización de agentes antimicrobianos en cualquier situación, incluido el uso en el hombre, los animales y demás utilizaciones (en estudio). La resistencia a los agentes antimicrobianos derivada de la administración de agentes antimicrobianos con fines terapéuticos o no terapéuticos ha inducido la selección y diseminación de microorganismos resistentes a los agentes antimicrobianos, y la consecuente pérdida de eficacia terapéutica de uno o varios agentes antimicrobianos, tanto en la medicina humana como en veterinaria.

2.

Objetivo A efectos del presente capítulo, el principal objetivo del análisis del riesgo es ofrecer a los Países miembros un método transparente, objetivo y justificable científicamente para proceder a la evaluación y gestión de los riesgos que entrañan para la salud de las personas y la sanidad de los animales acuáticos la selección y la propagación de la resistencia que puede surgir como consecuencia de la administración de agentes antimicrobianos a los animales acuáticos. Las Directrices del Codex para el análisis de riesgos de resistencia a los antimicrobianos transmitida por los alimentos (CAC/GL77-2011) incluyen información sobre dicho tema en relación con el uso de agentes antimicrobianos en especies distintas del ser humano.

3.

Proceso de análisis del riesgo Los componentes del análisis del riesgo que se describen en este capítulo son la identificación del peligro, la evaluación del riesgo, la gestión del riesgo y la información sobre el riesgo. El capítulo incluye factores que se deben tener en cuenta en las distintas etapas del proceso de análisis del riesgo. Estos factores no pretenden ser exhaustivos y no todos los elementos serán aplicables en todas las situaciones.

4.

Identificación del peligro A efectos del presente capítulo, el peligro es el microorganismo resistente o el determinante de resistencia que surge de la administración a los animales acuáticos de un agente antimicrobiano específico. Esta definición refleja la posibilidad de que los microorganismos resistentes causen efectos adversos en la salud, así como la posibilidad de una transferencia horizontal de determinantes genéticos entre microorganismos. Las circunstancias en las que el peligro puede tener consecuencias adversas son todas las situaciones en las cuales personas o animales acuáticos puedan verse expuestos a un agente patógeno resistente a los agentes antimicrobianos, caigan enfermos y se traten con un agente antimicrobiano que haya perdido eficacia.

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Anexo 12 (cont.) 5.

Evaluación del riesgo La evaluación del riesgo que entrañan para la salud de las personas y la sanidad de los animales acuáticos los microorganismos resistentes a los agentes antimicrobianos como resultado de la administración de agentes antimicrobianos a los animales acuáticos deberá tener en cuenta: a)

la probabilidad de emergencia de microorganismos resistentes como consecuencia de la administración de un agente antimicrobiano o, más específicamente, la propagación de determinantes de resistencia, si existe posibilidad de transmisión entre microorganismos;

b)

todas las vías posibles de exposición de las personas y los animales acuáticos a microorganismos resistentes o a determinantes de resistencia, la importancia de dichas vías y las probabilidades de exposición;

c)

las consecuencias de la exposición en términos de riesgos para la salud de las personas o la sanidad de los animales acuáticos.

Los principios generales de la evaluación del riesgo definidos en el Capítulo 2.1. se aplican por igual, tanto a la evaluación del riesgo cuantitativa como a la cualitativa. Como mínimo, siempre deberá llevarse a cabo una evaluación del riesgo cualitativa. Artículo 6.5.2. Consideraciones especiales para efectuar un análisis del riesgo de resistencia a los agentes antimicrobianos en acuicultura 1.

Introducción El análisis de riesgo de resistencia a los agentes antimicrobianos en acuicultura se enfrenta a una variedad de factores que tienen un impacto tanto en la evaluación como en la gestión del riesgo, entre ellos, la diversidad de la acuicultura, la ausencia relativa de métodos para el cultivo y de pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, la falta relativa de medicamentos aprobados y el potencial para el desarrollo de reservorios de microorganismos resistentes y de determinantes de resistencia con un potencial de transmisión horizontal. Sin embargo, los principios fundamentales del análisis del riesgo (evaluación del riesgo, gestión del riesgo e información sobre el riesgo) brindan un marco de trabajo tan válido para la acuicultura como para la producción de animales terrestres.

2.

Definición del riesgo Las definiciones de riesgo utilizadas en este capítulo son aquellas asociadas con el uso de agentes antimicrobianos en la acuicultura. Debido a que muchas de las operaciones de acuicultura (en particular, en los sistemas abiertos) se entrecruzan con la producción de animales terrestres y con entornos humanos, es esencial identificar claramente el riesgo que se ha de evaluar. La selección y la diseminación de microorganismos resistentes o de determinantes de resistencia pueden estar asociadas con el uso de agentes antimicrobianos en animales acuáticos, o resultar de su utilización en operaciones cercanas de producción ganadera o de la presencia de agentes antimicrobianos en aguas residuales provenientes del consumo humano. Por consiguiente, en la evaluación del riesgo, se deberá prestar una atención especial al diseño de los programas de colecta de datos para abarcar estos factores de interferencia.

3.

Diversidad de la acuicultura La variedad de especies cultivadas, la cantidad y diversidad de sistemas de cultivos y la gama de agentes antimicrobianos y sus vías de administración tienen un impacto en los elementos de la evaluación de riesgos, en particular, en la evaluación de la difusión. De este modo, se ha de ser muy cuidadoso a la hora de agrupar sectores aparentemente similares de la industria acuícola. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

45 

Anexo 12 (cont.)

La diversidad de la acuicultura también influye en la identificación, la selección y el seguimiento de las opciones de gestión del riesgo. 4.

Ausencia de métodos para el cultivo y de pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos En la actualidad, en la acuicultura, se carece de métodos estandarizados para las pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos en muchas especies importantes, lo que resulta en una pérdida en la capacidad de cuantificar riesgos específicos y en un aumento de la incertidumbre concomitante. Siempre que existan, se deberán usar los métodos estandarizados de susceptibilidad y, en su ausencia, aplicar enfoques claramente definidos y basados en la ciencia.

5.

Falta de medicamentos aprobados El número reducido de agentes antimicrobianos aprobados para uso en la acuicultura plantea desafíos en el análisis del riesgo, tanto en términos de la evaluación como de la gestión del riesgo. Es importante la colecta y utilización de información detallada acerca de los tipos y las cantidades de agentes antimicrobianos utilizados en la acuicultura y pertinentes para el análisis del riesgo. En algunas circunstancias, también se ha de tener en cuenta la utilización derogatoria o no prevista en la autorización de comercialización. Ver Capítulo 6.3. Para la gestión del riesgo, factores como la cantidad reducida de medicamentos aprobados y la diversidad de aspectos reglamentarios y de infraestructura sanitaria para los animales acuáticos en los países activos en el sector representan un desafío adicional. Las opciones de gestión del riesgo deberán ser prácticas y tener en cuenta la posibilidad real de aplicación y ejecución. En cuanto a los programas de seguimiento y vigilancia, la ausencia de medicamentos aprobados implica recurrir a sistemas de colecta de datos e información sobre las cantidades de agentes antimicrobianos empleados que no se limiten a la distribución autorizada o a los medicamentos aprobados, sino que también contemplen el uso de medicamentos sin autorización.

6.

Potencial para el desarrollo de un reservorio (transmisión horizontal) Los microorganismos que habitan el entorno acuícola constituyen el reservorio fundamental de determinantes de resistencia en la biosfera. Este reservorio representa el origen básico de todos los determinantes de resistencia a los agentes antimicrobianos, tanto en medicina humana como veterinaria. La frecuencia de determinantes de resistencia en microorganismos ambientales se mantiene por factores intrínsecos no generados por el hombre, y todos los usos de agentes antimicrobianos, incluyendo en la acuicultura, tienen el potencial de aumentar el tamaño del reservorio. Existe el riesgo que la utilización de agentes antimicrobianos en la acuicultura traiga como consecuencia un incremento de la frecuencia de determinantes en el microbioma ambiental y este aumento de frecuencia se transfiere a los microorganismos capaces de infectar a los humanos, y a los animales terrestres y acuáticos. La evaluación y gestión del riesgo es extremadamente compleja. Las vías biológicas para la evaluación de la difusión y la exposición son innumerables y, por el momento, no se pueden brindar orientaciones específicas. Artículo 6.5.3.

Análisis de los riesgos para la salud humana 1.

Definición del riesgo Infección de seres humanos por microorganismos que han adquirido resistencia debido a la administración de agentes antimicrobianos a los animales acuáticos, y la consecuente pérdida del beneficio de la terapia antimicrobiana destinada a combatir la infección humana.

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Anexo 12 (cont.)

2.

Identificación del peligro ‒

Microorganismos que han adquirido resistencia (incluso resistencia múltiple) como consecuencia de la administración de un agente antimicrobiano a los animales acuáticos.



Microorganismos que han adquirido un determinante de resistencia de otros microorganismos que, a su vez, han adquirido resistencia como consecuencia de la administración de un agente antimicrobiano a los animales acuáticos.

La identificación del peligro deberá tener en cuenta la clase o subclase del agente antimicrobiano considerado. Esta definición deberá leerse conjuntamente con el punto 4 del Artículo 6.5.1. 3.

Evaluación de la difusión La evaluación de la difusión describe las vías biológicas necesarias para que el uso de un agente antimicrobiano específico en los animales acuáticos conlleve a la liberación de microorganismos resistentes o de determinantes de resistencia en un ambiente dado. Asimismo, estima cualitativa o cuantitativamente la probabilidad de que se produzca ese proceso completo. La evaluación de la difusión describe la probabilidad de entrada de cada uno de los peligros posibles en una serie de circunstancias concretas con respecto a cantidades y momentos, e indica las posibilidades de modificación debido a diferentes acciones, acontecimientos o medidas. La evaluación de la difusión deberá tener en cuenta los siguientes factores: ‒

especies de animales acuáticos tratados con el agente antimicrobiano considerado;

‒ 

sistema de producción acuícola (intensivo/extensivo, en redes, tanques, jaulas, estanques, etc.);  



número de animales acuáticos tratados, su edad y distribución geográfica;



prevalencia de la enfermedad para la cual esté indicado el agente antimicrobiano en la población de animales acuáticos de destino;



datos sobre las tendencias de la utilización del agente antimicrobiano y de los cambios en los sistemas de producción en acuicultura;



datos sobre usos no autorizados o no previstos en la etiqueta;



métodos y vías de administración del agente antimicrobiano;



régimen de dosificación (dosis, intervalo de administración y duración del tratamiento);



propiedades farmacocinéticas y pertinentes propiedades farmacodinámicas del agente antimicrobiano;

‒ 

prevalencia de los agentes patógenos que pueden desarrollar resistencia en una especie de animales acuáticos;



mecanismos y vías de transmisión directa o indirecta de la resistencia;

‒ 

posible relación entre las características de la virulencia y la resistencia;



resistencia cruzada o coresistencia con otros agentes antimicrobianos;



datos sobre las tendencias y la aparición de microorganismos resistentes obtenidos mediante la vigilancia de los animales acuáticos, de los productos derivados de animales acuáticos y de los consiguientes residuos.

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Anexo 12 (cont.) En la evaluación de la difusión, se deberán considerar los siguientes factores de interferencia: ‒

4.

los microorganismos resistentes o los determinantes de resistencia asociados con los animales acuáticos o con los productos de animales acuáticos resultado de la contaminación del entorno terrestre o acuático, de los piensos o del procesamiento poscría.

Evaluación de la exposición La evaluación de la exposición describe las vías biológicas necesarias para la exposición de las personas a los microorganismos resistentes o a los determinantes de resistencia propagados por la administración de un agente antimicrobiano a los animales acuáticos, y calcula la probabilidad de que se produzcan esas exposiciones. La probabilidad de exposición a los peligros identificados se estima con relación a determinadas condiciones de exposición, en función de las cantidades, el momento, la frecuencia, la duración de la exposición, las vías de exposición, la especie y otras características de la población humana expuesta. La evaluación de la exposición deberá tener en cuenta los siguientes factores:

5.



demografía humana, incluidas subpoblaciones, y hábitos de consumo de alimentos, incluidas las costumbres y tradiciones culturales respecto a la preparación y al almacenaje de alimentos;



prevalencia de microorganismos resistentes en los alimentos en el momento de consumirlos;



carga microbiana en alimentos contaminados en el momento de consumirlos;



contaminación medioambiental por microorganismos resistentes;



transmisión de microorganismos resistentes entre las personas, los animales acuáticos y el medio ambiente;



medidas tomadas para la descontaminación microbiana de los alimentos;



capacidad de supervivencia y propagación de los microorganismos resistentes durante el proceso de producción de los alimentos (incluidas las operaciones de sacrificio, transformación, almacenamiento, transporte y venta al por menor);



métodos de eliminación de los desechos y probabilidad de exposición humana a microorganismos resistentes o a determinantes de resistencia a través de dichos residuos;



capacidad de los microorganismos resistentes de establecerse en los seres humanos;



transmisión de los microorganismos considerados de ser humano a ser humano;



capacidad de los microorganismos resistentes de transmitir resistencia a los microorganismos comensales del organismo humano y a los agentes zoonóticos;



cantidad y tipo de agentes antimicrobianos utilizados para tratar a los seres humanos;

‒ 

propiedades farmacocinéticas, como metabolismo, biodisponibilidad y distribución en la flora intestinal.

Evaluación de las consecuencias La evaluación de las consecuencias describe la relación entre determinadas exposiciones a microorganismos resistentes o a determinantes de resistencia y las consecuencias de esas exposiciones. Deberá existir un proceso causal por el que las exposiciones tienen consecuencias sanitarias o medioambientales perjudiciales que puedan, a su vez, tener consecuencias socioeconómicas. La evaluación de las consecuencias describe las posibles repercusiones de una exposición dada y estima la probabilidad de que se produzcan.

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48

Anexo 12 (cont.)

La evaluación de las consecuencias deberá tener en cuenta los siguientes factores:

6.



dosis microbiana y consiguientes interacciones de respuesta del hospedador;



variaciones de susceptibilidad de las poblaciones o subpoblaciones expuestas;



variaciones y frecuencia de los efectos en la salud humana de la pérdida de eficacia de los agentes antimicrobianos y los costes derivados;



posible relación entre las características de la virulencia y la resistencia;



cambios de hábitos de consumo de alimentos debidos a una pérdida de confianza en la seguridad sanitaria de los productos alimentarios y riesgos secundarios asociados;



interferencia con una terapia antimicrobiana en los seres humanos;



importancia del agente antimicrobiano en medicina humana;



prevalencia de la resistencia en los seres humanos de los agentes patógenos bacterianos considerados.

Estimación del riesgo La estimación del riesgo integra los resultados de la evaluación de la difusión, la evaluación de la exposición y la evaluación de las consecuencias para obtener una estimación general de los riesgos asociados a los peligros. Por consiguiente, la estimación del riesgo toma en cuenta todo el proceso de materialización del riesgo, desde la identificación del peligro hasta los efectos indeseables. La estimación del riesgo deberá tener en cuenta los siguientes factores: ‒

número de personas que se enferman y proporción de estas personas infectadas por microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos;



efectos adversos en subpoblaciones humanas vulnerables (niños, personas inmunocomprometidas, personas de edad avanzada, mujeres embarazadas, etc.);



aumento de la gravedad o de la duración de la enfermedad infecciosa;



número de personas/días de enfermedad al año; ‒ muertes (número total de muertes al año; probabilidad de que muera al año cualquier miembro de la población o un miembro de una determinada subpoblación, o de que vea reducida su esperanza de vida) vinculadas a microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos en comparación con las muertes vinculadas a microorganismos sensibles de la misma especie;

7.



gravedad de la enfermedad causada por los microorganismos resistentes considerados;



disponibilidad y coste de una terapia antimicrobiana alternativa;

‒ 

posibles repercusiones de cambiar por un agente antimicrobiano alternativo (por ejemplo, mayor toxicidad de los productos de sustitución);



aparición de resistencia a agentes antimicrobianos en los agentes patógenos considerados observada en las personas.

Gestión del riesgo La OIE define la gestión del riesgo como el conjunto de los siguientes pasos. a)

Evaluación del riesgo Evaluación del riesgo: designa el proceso de comparación del riesgo estimado en la evaluación del riesgo con la reducción del riesgo que se espera de las medidas de gestión del riesgo propuestas. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 12 (cont.)

b)

Evaluación de las opciones Existen varias opciones de gestión del riesgo para minimizar la aparición y diseminación de resistencia a los agentes antimicrobianos, que pueden ser reglamentarias o no, como la elaboración de códigos de práctica para el uso de agentes antimicrobianos en la ganadería. En la toma de decisiones en materia de gestión del riesgo, es necesario tener en cuenta todas las implicaciones de las diferentes opciones en la salud de las personas y en la sanidad y el bienestar de los animales acuáticos, así como las consideraciones económicas y medioambientales asociadas. Un control eficaz de ciertas enfermedades de los animales acuáticos puede tener la doble ventaja de reducir los riesgos para la salud humana derivados tanto del agente bacteriano en consideración como de la resistencia a los agentes antimicrobianos.

c)

Implementación Los gestores del riesgo deberán desarrollar un plan de implementación que describa cómo, quién y cuándo se aplicará la decisión. Las Autoridades competentes deberán garantizar un marco reglamentario y una infraestructura adecuados.

d)

Seguimiento y revisión Deberá llevarse a cabo un seguimiento ininterrumpido y una revisión continua de las distintas opciones de gestión del riesgo, con el fin de garantizar que se estén cumpliendo los objetivos.

8.

Comunicación sobre el riesgo Deberá promoverse la comunicación con todas las partes interesadas a la menor oportunidad, e integrarse en todas las fases de análisis del riesgo. Ello permitirá que todas las partes interesadas, incluidos los gestores del riesgo, comprendan mejor los enfoques de la gestión del riesgo. La comunicación sobre el riesgo también deberá quedar bien documentada. Artículo 6.5.4.

Análisis de los riesgos para la salud de los animales acuáticos 1.

Definición del riesgo Infección de animales acuáticos por microorganismos que han adquirido resistencia debido a la administración de agentes antimicrobianos a los animales acuáticos, y la consecuente pérdida del beneficio de la terapia antimicrobiana destinada a combatir la infección en los animales acuáticos.

2.

Identificación del peligro ‒

Microorganismos que han adquirido resistencia (incluso resistencia múltiple) como consecuencia de la administración de un agente antimicrobiano a los animales acuáticos.



Microorganismos que han adquirido un determinante de resistencia de otros microorganismos que, a su vez, han adquirido resistencia como consecuencia de la administración de un agente antimicrobiano a los animales acuáticos.

La identificación del peligro deberá tener en cuenta la clase o subclase del agente antimicrobiano considerado. Esta definición deberá leerse conjuntamente con el punto 4 del Artículo 6.5.1. 3.

Evaluación de la difusión La evaluación de la difusión deberá tener en cuenta los siguientes factores: ‒

especies de animales acuáticos tratados con el agente antimicrobiano en cuestión;

‒ 

sistema de producción acuícola (intensivo/extensivo, en redes, tanques, jaulas, estanques, etc.);  



número de animales acuáticos tratados, y su edad, distribución geográfica y, en su caso, sexo;

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 12 (cont.)

‒ 

prevalencia de la enfermedad para la cual esté indicado el agente antimicrobiano en la población de animales acuáticos de destino;



datos sobre las tendencias de la utilización del agente antimicrobiano y de los cambios en los sistemas de producción de acuicultura;



datos sobre los posibles usos no autorizados o no previstos en la etiqueta;



régimen de dosificación (dosis, intervalo de administración y duración del tratamiento);



métodos y vías de administración del agente antimicrobiano;



propiedades farmacocinéticas y pertinentes propiedades farmacodinámicas del agente antimicrobiano;



lugar y tipo de infección;



desarrollo de microorganismos resistentes;



mecanismos y vías de transmisión de la resistencia;



resistencia cruzada o coresistencia con otros agentes antimicrobianos;



datos sobre las tendencias y la aparición de microorganismos resistentes obtenidos mediante la vigilancia de los animales acuáticos, de los productos derivados de animales acuáticos y de los consecuentes residuos.

En la evaluación de la difusión, se deberán considerar los siguientes factores de interferencia: ‒

4.

los microorganismos resistentes o los determinantes de resistencia asociados con los animales acuáticos o con los productos de animales acuáticos resultado de la contaminación del entorno terrestre o acuático, de los piensos o del procesamiento poscría.

Evaluación de la exposición La evaluación de la exposición deberá tener en cuenta los siguientes factores: ‒

prevalencia y tendencias de los microorganismos resistentes en los animales acuáticos clínicamente enfermos y clínicamente no afectados;



prevalencia de microorganismos resistentes en los alimentos y en los entornos acuáticos;



transmisión de microorganismos resistentes y sus determinantes de resistencia de animal a animal (prácticas de producción de los animales acuáticos y desplazamientos de los animales acuáticos);



número o porcentaje de animales acuáticos tratados;



cantidades y tendencias de los agentes antimicrobianos administrados a los animales acuáticos;



capacidad de supervivencia y propagación de los microorganismos resistentes;



exposición de la fauna silvestre a microorganismos resistentes;



métodos de eliminación de los residuos y probabilidad de exposición de los animales acuáticos a microorganismos resistentes o a determinantes de resistencia a través de dichos residuos;



capacidad de los microorganismos resistentes de establecerse en los animales acuáticos;



exposición a determinantes de resistencia procedentes de otras fuentes, como agua, aguas residuales, contaminación por residuos, etc.; Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 12 (cont.)

5.



propiedades farmacocinéticas, como metabolismo, biodisponibilidad y distribución en la flora  intestinal, puesto que la flora gastrointestinal de muchas especies de animales acuáticos puede ser transitorias;



transmisión de microorganismos resistentes y determinantes de resistencia entre las personas, los animales acuáticos y el medio ambiente.

Evaluación de las consecuencias La evaluación de las consecuencias deberá tener en cuenta los siguientes factores:

6.



dosis microbiana y consiguientes interacciones de respuesta del hospedador;



variaciones de susceptibilidad a la enfermedad de las poblaciones o subpoblaciones expuestas;



variaciones y frecuencia de los efectos de la pérdida de eficacia de los agentes antimicrobianos en la salud de los animales acuáticos y los costes derivados;



posible relación entre las características de la virulencia y la resistencia;



importancia del agente antimicrobiano en la salud de los animales acuáticos (consúltese la lista de la OIE de agentes antimicrobianos de importancia en veterinaria).

Estimación del riesgo La estimación del riesgo deberá tener en cuenta los siguientes factores:

7.



carga adicional de enfermedad debido a microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos;



número de fracasos terapéuticos debidos a microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos;



aumento de la gravedad o de la duración de la enfermedad infecciosa;

‒ 

consecuencias para el bienestar de los animales;

‒ 

estimación del impacto económico y del coste para la salud y la producción de animales acuáticos;



muertes (número total de muertes al año; probabilidad de que muera al año cualquier miembro de la población o un miembro de una determinada subpoblación) vinculadas a microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos en comparación con las muertes vinculadas a microorganismos sensibles de la misma especie;



disponibilidad y coste de una terapia antimicrobiana alternativa;

‒ 

posibles repercusiones por pasar a un agente antimicrobiano alternativo (por ejemplo, una mayor toxicidad de los productos de sustitución);

Gestión del riesgo Serán de aplicación las pertinentes disposiciones del punto 7 del Artículo 6.5.3.

8.

Información sobre el riesgo Serán de aplicación las pertinentes disposiciones del punto 8 del Artículo 6.5.3.

-------------Texto suprimido.  Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

53 

Anexo 13 A

CAPÍTULO 8.1.

INFECCIÓN POR BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS […] Artículo 8.1.8. Importación, para la acuicultura, de animales acuáticos vivos de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por B. dendrobatidis 1)

Cuando se importen, para la acuicultura, animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.1.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por B. dendrobatidis, la Autoridad competente del país importador deberá exigir: a)

la presentación de un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, extendido por la Autoridad competente del país exportador que acredite que los animales acuáticos de las especies mencionadas en el Artículo 8.1.2. han sido tratados de modo apropiado para erradicar la infección y posteriormente han sido sometidos a pruebas que confirman la ausencia de la enfermedad, de conformidad con las disposiciones que figuran en el capítulo correspondiente del Manual Acuático; O

b)

evaluar el riesgo y aplicar, si se justifican, las siguientes medidas para reducirlo: a)

entrega directa de la remesa a instalaciones biológicamente seguras donde permanezca el resto de su vida continuamente aislada del medio local;

b)

tratamiento del agua utilizada para el transporte y de todos los efluentes y despojos de modo que garantice la inactivación de B. dendrobatidis.

2)

Si el objetivo de la importación es la creación de una población nueva, deberán tomarse en cuenta los aspectos pertinentes del Código de prácticas para la introducción y traslado de organismos marinos del Consejo internacional para la exploración del mar (ICES).

3)

A efectos del Código acuático, los elementos pertinentes que establece el Código del ICES (versión íntegra: http://www.ices.dk/publications/our-publications/Pages/Miscellaneous.aspx) son los siguientes: a)

identificar las poblaciones de interés (de cultivo o naturales) en las instalaciones donde se encuentran;

b)

evaluar el historial sanitario de las poblaciones;

c)

tomar y examinar muestras para detectar la presencia de B. dendrobatidis y de parásitos y para determinar el estado general de salud de la población;

d)

importar y mantener en cuarentena, en instalaciones seguras, una población fundadora (F-0);

e)

producir una generación F-1 con la población F-0 mantenida en cuarentena;

f)

criar la población F-1 y tomar y examinar muestras de la misma en los momentos críticos de su desarrollo (ciclo de vida) para detectar la presencia de infección por B. dendrobatidis y de parásitos y para determinar su estado general de salud;

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54

Anexo 13 A (cont.)

4)

g)

si no se detecta la presencia de infección por B. dendrobatidis ni de parásitos y si se considera que el estado general de salud de la población reúne las condiciones elementales de bioseguridad requeridas por el país, la zona o el compartimento de importación, la población F-1 podrá ser reconocida libre de infección por B. dendrobatidis o del agente patógeno específico de esta infección;

h)

liberar de la cuarentena la población F-1 libre del agente patógeno específico e introducirla en el país, la zona o el compartimento para fines de acuicultura o de repoblación.

Con respecto al apartado 3 e), las condiciones de cuarentena deben ser propicias a la multiplicación del agente patógeno y, en última instancia, a la expresión clínica. Si las condiciones de cuarentena no son adecuadas para la multiplicación y el desarrollo del agente patógeno, el enfoque de diagnóstico recomendado podría no ser lo suficientemente sensible como para detectar un nivel de infección bajo.

Este artículo no se aplica a los animales acuáticos mencionados en el punto 1 del Artículo 8.1.3. […] Artículo 8.1.10. Importación de animales acuáticos vivos destinados a la alimentación de los animales, a los laboratorios, a los parques zoológicos, al comercio de mascotas o al uso agrícola, industrial o farmacéuticoa, procedentes de un país, una zona o un compartimento no declarado libre de infección por B. dendrobatidis Cuando se importen, para la alimentación de los animales o para uso agrícola, industrial o farmacéutico, animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.1.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por B. dendrobatidis, la Autoridad competente del país importador deberá exigir: 1)

entrega directa de la remesa a instalaciones de cuarentena en donde permanecerán para sacrificio y transformación en productos autorizados por la Autoridad competente; y

2)

tratamiento del agua utilizada para el transporte y de todos los efluentes y despojos de modo que garantice la inactivación de B. dendrobatidis.

Cuando se importen animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.1.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por B. dendrobatidis, la Autoridad competente del país importador exigirá: 1)

la presentación de un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, extendido por la Autoridad competente del país exportador que acredite que los animales acuáticos han sido tratados de modo apropiado para erradicar la infección y posteriormente han sido sometidos a pruebas que confirman la ausencia de enfermedades, de conformidad con las disposiciones que figuran en el capítulo correspondiente del Manual Acuático;

O 2)

evaluar el riesgo y aplicar las siguientes medidas para reducirlo: a)

entrega directa de la remesa a instalaciones biológicamente seguras donde permanezca el resto de su vida continuamente aislada del medio local;

b)

tratamiento del agua utilizada para el transporte y de todos los efluentes y despojos de modo que garantice la inactivación de B. dendrobatidis.

Este artículo no se aplica a las mercancías mencionadas en el punto 1 del Artículo 8.1.3.

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55 

Anexo 13 A (cont.)

[…] Artículo 8.1.13. Importación de animales acuáticos vivos destinados al uso en laboratorios o parques zoológicos de un país, una zona o un compartimento no declarado libre de infección por B. dendrobatidis Cuando se importen, para uso en laboratorios y zoológicos animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.1.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por B. dendrobatidis, la Autoridad competente del país importador deberá exigir: 1)

entrega directa de la remesa a instalaciones de cuarentena autorizadas por la Autoridad competente en donde permanecerán definitivamente; y

2)

tratamiento del agua utilizada para el transporte de modo que garantice la inactivación de B. dendrobatidis;

3)

eliminación de las canales de acuerdo con el Capítulo 4.6. […]

-------------Texto suprimido.

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57 

Anexo 13 B

CAPÍTULO 8.2.

INFECCIÓN POR RANAVIRUS […] Artículo 8.2.10. Importación de animales acuáticos vivos destinados a la alimentación de los animales, a los laboratorios, a los parques zoológicos, al comercio de mascotas o al uso agrícola, industrial o farmacéutica, procedentes de un país, una zona o un compartimento no declarado libre de infección por ranavirus Cuando se importen, para la alimentación de los animales o para uso agrícola, industrial o farmacéutico, animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.2.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por ranavirus, la Autoridad competente del país importador deberá exigir: 1)

entrega directa de la remesa a instalaciones de cuarentena en donde permanecerán para sacrificio y transformación en productos autorizados por la Autoridad competente; y

2)

tratamiento del agua utilizada para el transporte y de todos los efluentes y despojos resultantes de la transformación de modo que garantice la inactivación de ranavirus;

Cuando se importen animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.2.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por ranavirus, la Autoridad competente del país importador exigirá evaluar el riesgo y aplicar las siguientes medidas para reducirlo: 1)

entrega directa de la remesa a instalaciones biológicamente seguras donde permanezca el resto de su vida continuamente aislada del medio local;

2)

tratamiento del agua utilizada para el transporte y de todos los efluentes y despojos de modo que garantice la inactivación de ranavirus.

Este artículo no se aplica a las mercancías mencionadas en el punto 1 del Artículo 8.2.3. […] Artículo 8.2.13. Importación de animales acuáticos vivos destinados a los laboratorios o parques zoológicos procedentes de un país, una zona o un compartimento no declarado libre de infección por ranavirus Cuando se importen, para uso en laboratorios y zoológicos animales acuáticos vivos de las especies mencionadas en el Artículo 8.2.2. de un país, una zona o un compartimento no declarado(a) libre de infección por ranavirus, la Autoridad competente del país importador deberá exigir: 1)

entrega directa de la remesa a instalaciones de cuarentena autorizadas por la Autoridad competente en donde permanecerán definitivamente;

2)

tratamiento del agua utilizada para el transporte de modo que garantice la inactivación de ranavirus;

3)

eliminación de las canales de acuerdo con el Capítulo 4.6.

-------------Texto suprimido. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

59 

Anexo 14

Artículos X.X.7. y X.X.11. [Nota: este tema concierne a los Artículos 10.4.10., 10.4.11., 10.4.15. y 10.4.16. del Capítulo 10.4.] Artículo X.X.7. Importación de animales acuáticos vivos y de productos de animales acuáticos de un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de necrosis hematopoyética epizoótica Cuando se importen animales acuáticos vivos y de productos de animales acuáticos de las especies mencionadas en el Artículo 10.1.2. de un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de necrosis hematopoyética epizoótica, la Autoridad competente del país importador deberá exigir la presentación de un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, extendido por la Autoridad competente del país exportador o por un certificador oficial aprobado por el país importador, que acredite, según los procedimientos descritos en los Artículos 10.1.4. ó 10.1.5. (según proceda) y 10.1.6., que el lugar de producción de la remesa de animales acuáticos vivos y de productos de animales acuáticos de es un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de necrosis hematopoyética epizoótica. El certificado deberá ser conforme al modelo de certificado que figura en el Capítulo 5.11. Este artículo no se aplica a las mercancías enumeradas en el punto 1 del Artículo 10.1.3. Artículo X.X.11. Importación de productos de animales acuáticos de un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de necrosis hematopoyética epizoótica Cuando se importen productos de animales acuáticos de las especies mencionadas en el Artículo 10.1.2. de un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de necrosis hematopoyética epizoótica, la Autoridad competente del país importador deberá exigir la presentación de un certificado sanitario internacional aplicable a los animales acuáticos, extendido por la Autoridad competente del país exportador o por un certificador oficial aprobado por el país importador, que acredite, según los procedimientos descritos en los Artículos 10.1.4. ó 10.1.5. (según proceda) y 10.1.6., que el lugar de producción de la remesa de productos de animales acuáticos es un país, una zona o un compartimento declarado(a) libre de necrosis hematopoyética epizoótica. El certificado deberá ser conforme al modelo de certificado que figura en el Capítulo 5.11. Este artículo no se aplica a las mercancías enumeradas en el punto 1 del Artículo 10.1.3.

-------------Texto suprimido.

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61 

Anexo 15

CAPÍTULO 10.4.

INFECCIÓN POR VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN […] Artículo 10.4.4. País libre de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón En este artículo, todas las consideraciones se entenderán hechas a un país libre de infección por cualquier virus detectable de la anemia infecciosa del salmón, incluido el virus de la anemia infecciosa del salmón HPR0. Si el país comparte una zona con otro u otros países, sólo podrá hacer una autodeclaración de ausencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón cuando todos los perímetros de aguas compartidas hayan sido declarados países o zonas libres de esta infección (véase el Artículo 10.4.6.). Como se describe en el Artículo 1.4.6., un país podrá hacer una autodeclaración de ausencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón si: 1)

ninguna especie susceptible de las mencionadas en el Artículo 10.4.2. está presente en el país y se han reunido ininterrumpidamente las condiciones elementales de bioseguridad durante, por lo menos, los dos últimos años;

O 2)

se desconoce el estatus de la enfermedad antes de la vigilancia específica, cualquiera de las especies susceptibles mencionadas en el Artículo 10.4.2. está presente en el país y no se ha observado la presencia detectable de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón, pero se han dado las condiciones siguientes: a)

se han reunido ininterrumpidamente las condiciones elementales de bioseguridad durante, por lo menos, los dos últimos años, y

b)

se ha aplicado una vigilancia específica, de conformidad con lo descrito en el Capítulo 1.4., durante, por lo menos, los dos últimos años y no se ha detectado la presencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón;

O 3)

había hecho previamente una autodeclaración de ausencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón y perdió posteriormente su estatus libre de enfermedad por haberse detectado la infección por virus de la anemia infecciosa del salmón, pero se han dado las condiciones siguientes: a)

nada más haberse detectado la enfermedad, el lugar afectado ha sido declarado zona infectada y se ha establecido una zona de protección, y

b)

las poblaciones infectadas han sido destruidas o desplazadas de la zona infectada con medios que reducen al mínimo el riesgo de propagación de la enfermedad y se han aplicado los procedimientos de desinfección apropiados (descritos en el Manual Acuático), y

c)

las condiciones elementales de bioseguridad vigentes anteriormente han sido debidamente revisadas y modificadas y se han reunido ininterrumpidamente desde la erradicación de la enfermedad, y

d)

se ha aplicado una vigilancia específica, de conformidad con lo descrito en el Capítulo 1.4., durante, por lo menos, los dos últimos años y no se ha detectado la presencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón. Mientras tanto, parte o la totalidad del lugar no afectado podrá ser declarada zona libre, siempre que reúna las condiciones descritas en el punto 3 del Artículo 10.4.6.

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Anexo 15 (cont.) No podrá seguirse la vía de autodeclaración de ausencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón HPR0 basada en la ausencia de enfermedad clínica (la ausencia histórica a la que se refiere el Artículo 1.4.6.) porque es poco probable que la infección por virus de la anemia infecciosa del salmón dé lugar a signos clínicos.

[…] Artículo 10.4.6. Zona o compartimento libre de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón En este artículo, todas las consideraciones se entenderán hechas a una zona o un compartimento libre de infección por cualquier virus detectable de la anemia infecciosa del salmón, incluido el virus de la anemia infecciosa del salmón HPR0. Si una zona o un compartimento se extiende más allá de las fronteras de un país, sólo podrá ser declarada(o) zona o compartimento libre de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón si las Autoridades competentes de todos los territorios que abarca confirman que reúne las condiciones exigidas para serlo. Como se describe en el Artículo 1.4.6., una zona o un compartimento establecida(o) en el territorio de un país o de un conjunto de países no declarado(s) libre(s) de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón podrá ser declarada(o) zona o compartimento libre de esta infección por la(s) Autoridad(es) competente(s) de dicho país o conjunto de países si: 1)

ninguna especie susceptible de las mencionadas en el Artículo 10.4.2. está presente en la zona o el compartimento y se han reunido ininterrumpidamente las condiciones elementales de bioseguridad durante, por lo menos, los dos últimos años;

O 2)

se desconoce el estatus de la enfermedad antes de la vigilancia específica, cualquiera de las especies susceptibles mencionadas en el Artículo 10.4.2. está presente en la zona o el compartimento y no se ha observado la presencia detectable de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón, pero se han dado las condiciones siguientes: a)

se han reunido ininterrumpidamente las condiciones elementales de bioseguridad durante, por lo menos, los dos últimos años, y

b)

se ha aplicado una vigilancia específica, de conformidad con lo descrito en el Capítulo 1.4., durante, por lo menos, los dos últimos años y no se ha detectado la presencia de infección por virus de la anemia infecciosa del salmón;

O 3)

una zona había hecho previamente una autodeclaración de ausencia de infección por virus de la anemia infecciosa y perdió posteriormente su estatus libre de enfermedad por haberse detectado la infección por virus de la anemia infecciosa en ella, pero se han dado las condiciones siguientes: a)

nada más haberse detectado la enfermedad, el lugar afectado ha sido declarado zona infectada y se ha establecido una zona de protección, y

b)

las poblaciones infectadas han sido destruidas o desplazadas de la zona infectada con medios que reducen al mínimo el riesgo de propagación de la enfermedad y se han aplicado los procedimientos de desinfección apropiados (descritos en el Manual Acuático), y

c)

las condiciones elementales de bioseguridad vigentes anteriormente han sido debidamente revisadas y modificadas y se han reunido ininterrumpidamente desde la erradicación de la enfermedad, y

d)

se ha aplicado una vigilancia específica, de conformidad con lo descrito en el Capítulo 1.4., durante, por lo menos, los dos últimos años y no se ha detectado la presencia de infección por virus de la anemia infecciosa.

-------------Texto suprimido. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

63 

Anexo 16

CHAPTER 2.2.2.

INFECTIOUS HYPODERMAL AND HAEMATOPOIETIC NECROSIS 1.

Scope Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis (IHHN) disease is caused by infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) (Bonami & Lightner, 1991; Bonami et al., 1990; Lightner, 1996a; 2011; Lightner et al., 1983a; 1983b; Lotz et al., 1995; Tang & Lightner, 2002). A large portion of the IHHNV genome has been found to be inserted in the genome of some genetic lines of Penaeus monodon. There is no evidence that this variant of IHHNV is infectious (Tang & Lightner, 2002; 2006). Synonyms: the International Committee on the Taxonomy has assigned IHHNV (a parvovirus) as a tentative species in the genus Brevidensovirus, family Parvoviridae with the species name of PstDNV (for Penaeus stylirostris densovirus) (Fauquet et al., 2005). For the purpose of this Aquatic Manual, most references to the viral agent of IHHN will be as IHHNV.

2.

Disease information 2.1. Agent factors 2.1.1.

Aetiological agent, agent strains

IHHNV is the smallest of the known penaeid shrimp viruses. The IHHN virion is a 20–22 nm, non-enveloped icosahedron, with a density of 1.40 g ml–1 in CsCl, contains linear single-stranded DNA with an estimated size of 3.9 kb, and has a capsid with four polypeptides of molecular weight 74, 47, 39, and 37.5 kD (Bonami et al., 1990; Nunan et al., 2000; GenBank AF218266). At least three distinct genotypes of IHHNV have been identified (Tang & Lightner, 2002; Tang et al., 2003b): Type 1) from the Americas and East Asia (principally the Philippines); Type 2) from South-East Asia; Type 3A) East Africa, India and Australia; and Type 3B) the western Indo-Pacific region including Madagascar, Mauritius and Tanzania (Tang & Lightner, 2006; Tang et al., 2007). The first two genotypes are infectious to the representative penaeids, P. vannamei and P. monodon, while the latter two genetic variants are not infectious to these species (Tang & Lightner, 2002; Tang et al., 2003b; 2007). IHHNV type 3A and type 3B related sequences have been found inserted into the genome of P. monodon from East Africa, Australia, and the western Indo-Pacific region (Tang & Lightner, 2006; Tang et al., 2007). The putative IHHNV sequences in the P. monodon genome are not infectious to the representative host species P. vannamei and P. monodon (Lightner et al., 2009; Tang & Lightner, 2006; Tang et al., 2007). 2.1.2.

Survival outside the host

No data. 2.1.3.

Stability of the agent (effective inactivation methods)

IHHNV is believed to be the most stable virus of the known penaeid shrimp viruses. Infected tissues remain infectious after repeated cycles of freeze–thawing and after storage in 50% glycerine (Lightner, 1996a; Lightner et al., 1987; 2009). 2.1.4.

Life cycle

Not applicable.

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Anexo 16 (cont.)

2.2. Host factors 2.2.1.

Susceptible host species

Most penaeid species can be infected with IHHNV, including the principal cultured species, P. monodon (black tiger shrimp/prawn), P. vannamei (Pacific white shrimp), and P. stylirostris (Pacific blue shrimp). IHHNV infections are most severe in the Pacific blue shrimp, P. stylirostris, where the virus can cause acute epizootics and mass mortality (> 90%). In P. stylirostris, the juvenile and subadult life stages are the most severely affected (Bell & Lightner, 1984; 1987; Brock & Lightner 1990; Brock et al., 1983; Lightner, 1996a; Lightner & Redman, 1998a; Lightner et al., 1983a). IHHNV causes the chronic disease runt-deformity syndrome (RDS) in P. vannamei in which reduced, irregular growth and cuticular deformities, rather than mortalities, are the principal effects (Bray et al., 1994; Browdy et al., 1993; Castille et al., 1993; Kalagayan et al., 1991; Lightner, 1996a; 1996b; Motte et al., 2003). IHHNV infection in P. monodon is usually subclinical, but RDS, reduced growth rates and reduced culture performance have been reported in IHHNV-infected stocks (Chayaburakul et al., 2004; Primavera & Quinitio, 2000). 2.2.2.

Susceptible stages of the host

IHHNV has been demonstrated in all life stages (i.e. eggs, larvae, postlarvae [PL], juveniles and adults) of P. vannamei. Eggs produced by IHHNV-infected females with high virus loads were found to generally fail to develop and hatch. Those nauplii produced from infected broodstock that do hatch have a high prevalence of IHHNV infection (Motte et al., 2003). 2.2.3.

Species or subpopulation predilection (probability of detection)

See Sections 2.2.1 and 2.2.2. 2.2.4.

Target organs and infected tissue

IHHNV infects and has been shown to replicate (using in-situ hybridisation [ISH] with specific DNA probes) in tissues of ectodermal and mesodermal origin from the embryo. Thus, the principal target organs include: the gills, cuticular epithelium (or hypodermis), all connective tissues, the haematopoietic tissues, the lymphoid organ, antennal gland, and the ventral nerve cord, its branches and its ganglia. The enteric organs (endoderm-derived hepatopancreas, midgut and midgut caeca mucosal epithelia) and smooth, cardiac, and striated muscle show no histological signs of infection by IHHNV and are usually negative for IHHNV by ISH (Lightner, 1993; 1996a; 2011; Lightner et al., 1992b). 2.2.5.

Persistent infection with lifelong carriers

Some members of P. stylirostris and P. vannamei populations that survive IHHNV infections and/or epizootics, may carry the virus for life and pass the virus on to their progeny and other populations by vertical and horizontal transmission (Bell & Lightner 1984; Lightner, 1996a; 1996b; Morales-Covarrubias & ChavezSanchez, 1999; Motte et al., 2003). 2.2.6.

Vectors

No vectors are known in natural infections. 2.2.7.

Known or suspected wild aquatic animal carriers

IHHNV is common in wild penaeid shrimp in South-East Asia (P. monodon) and in the Americas (P. vannamei, P. stylirostris and other Pacific side wild penaeid species) (Fegan & Clifford, 2001; Lightner, 1996a; Lightner et al., 2009; Morales-Covarrubias et al., 1999; Nunan et al., 2001).

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Anexo 16 (cont.)

2.3. Disease pattern 2.3.1.

Transmission mechanisms

Transmission of IHHNV can be by horizontal or vertical routes. Horizontal transmission by cannibalism or by contaminated water has been demonstrated (Lightner, 1996a; Lightner et al., 1983a; 1983b; 1985), as has vertical transmission via infected eggs (Motte et al., 2003). 2.3.2.

Prevalence

In regions where the virus is enzootic in wild stocks, the prevalence of IHHNV has been found in various surveys to range from 0 to 100%. Some reported mean values for IHHNV prevalence in wild stocks are: 26% and 46% in P. stylirostris in the lower and upper Gulf of California, respectively (Pantoja et al., 1999); 100% and 57%, respectively, in adult female and adult male P. stylirostris from the mid-region of the Gulf of California (Morales-Covarrubias et al., 1999); 28% in wild P. vannamei collected from the Pacific coast of Panama (Nunan et al., 2001); and from 51 to 63% in P. vannamei collected from the Pacific coasts of Ecuador, Colombia and Panama (Motte et al., 2003). Other penaeids collected during some of these surveys and found to be IHHNV positive included the brown shrimp, P. californiensis and the Western white shrimp P. occidentalis. In farms where IHHNV is present, its prevalence can range from very low to 100%, but high prevalence, approaching 100%, is typical (Chayaburakul et al., 2004; Lightner, 1988; 1996a; 1996b; Lightner et al., 1992a; 1983a; Martinez-Cordova, 1992). 2.3.3.

Geographical distribution

IHHNV appears to have a world-wide distribution in both wild and cultured penaeid shrimp (Brock & Lightner, 1990; Lightner, 1996a; 1996b; Owens et al., 1992). In the Western Hemisphere, IHHNV is commonly found in wild penaeid shrimp in the eastern Pacific from Peru to Mexico. Although IHHNV has been reported from cultured P. vannamei and P. stylirostris in most of the shrimp-culturing regions of the Western Hemisphere and in wild penaeids throughout their range along the Pacific coast of the Americas (Peru to northern Mexico), the virus has not been reported in wild penaeid shrimp on the Atlantic coast of the Americas (BondadReantaso et al., 2001; Brock & Main, 1994; Lightner, 1996a, 1996b; Lightner et al., 1992a; Lightner & Redman, 1998a). IHHNV has also been reported in cultured penaeid shrimp from Pacific islands including the Hawaiian Islands, French Polynesia, Guam, and New Caledonia. In the Indo-Pacific region, the virus has been reported from cultured and wild penaeid shrimp in East Asia, South-East Asia, and the Middle East (BondadReantaso et al., 2001; Lightner, 1996a). An IHHN-like virus has been reported from Australia (Krabsetsve et al., 2004; Owens et al., 1992), and the presence of IHHN in farmed prawns in Australia was reported to the OIE in 2008. As discussed in Section 2.1.1, IHHNV-related sequences have been found inserted into the genome of P. monodon from East Africa, Australia, and the western Indo-Pacific region (Tang & Lightner, 2006; Tang et al., 2007). 2.3.4.

Mortality and morbidity

Depending on the host species and the genotype of the virus, IHHN may take three distinct forms: in unselected P. stylirostris, infection by IHHNV results in an acute, usually catastrophic disease with mortalities approaching 100%. In contrast, in P. vannamei, some selected lines of P. stylirostris, and in P. monodon under some conditions, infection by IHHNV results in a more subtle, chronic disease, RDS, in which high mortalities are unusual, but significant growth suppression and cuticular deformities are common. In the third situation, a large portion of the IHHNV genome has been found to be inserted in the genome of some genetic lines of P. monodon. There is no evidence that this variant of IHHNV is infectious (Tang & Lightner, 2002; 2006). 2.3.5.

Environmental factors

The replication rate of IHHNV at high water temperatures was significantly reduced in a study in which viral replication was compared in P. vannamei experimentally infected and held at 24°C and 32°C. After a suitable incubation period, shrimp held at 32°C had approximately 102 lower viral load than shrimp held at 24°C. However, even at the higher temperature, significant (up to 105 virus copies 50 ng–1 of shrimp DNA) IHHNV replication still occurred in shrimp held at 32°C (Montgomery-Brock et al., 2007).

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Anexo 16 (cont.)

2.4. Control and prevention 2.4.1.

Vaccination

No effective vaccination methods for IHHNV have been developed. 2.4.2.

Chemotherapy

No scientifically confirmed reports of effective chemotherapy treatments. 2.4.3.

Immunostimulation

No scientifically confirmed reports of effective immunostimulation treatments. 2.4.4.

Resistance breeding

Selected stocks of P. stylirostris that are resistant to IHHN disease have been developed and these have had some successful application in shrimp farms (Clifford, 1998; Lightner, 1996a; 1996b; Weppe 1992; ZarianHerzberg & Ascencio-Valle, 2001). Some selected lines of P. stylirostris that were bred for IHHN disease resistance, were found to be refractory to infection (Tang et al., 2000). However, such stocks have no increased resistance to diseases such as white spot syndrome virus (WSSV), and, hence, their use has been limited, although with some stocks a genetic basis for IHHN susceptibility in P. vannamei has been reported (Alcivar-Warren et al., 1997). 2.4.5.

Restocking with resistant species

There has been some limited application and success with IHHNV-resistant P. stylirostris (Clifford, 1998; Lightner, 1996a; Weppe, 1992; Zarin-Herzberg & Ascencio 2001). The relative resistance of P. vannamei to IHHN disease, despite infection by IHHNV, is considered to be among the principal factors that led to P.vannamei being the principal shrimp species farmed in the Western Hemisphere and, since 2004, globally (Lightner, 2005; Lightner et al., 2009; Rosenberry, 2004). 2.4.6.

Blocking agents

There are reports of shrimp with high viral loads of IHHNV being resistant to infection by WSSV (Bonnichon et al., 2006; Tang et al., 2003a). However, there are no reports to date for IHHNV blocking agents. 2.4.7.

Disinfection of eggs and larvae

IHHNV has been demonstrated to be transmitted vertically by the transovarian route (Motte et al., 2003). Hence, while disinfection of eggs and larvae is good management practice (Chen et al., 1992) and is recommended for its potential to reduce IHHNV contamination of spawned eggs and larvae produced from them (and contamination by other disease agents), the method is not effective for preventing transmission of IHHNV (Motte et al., 2003). 2.4.8.

General husbandry practices

Some husbandry practices have been successfully applied to the prevention of IHHNV infections and disease. Among these has been the application of polymerase chain reaction (PCR) prescreening of wild or pondreared broodstock and/or their spawned eggs/nauplii and discarding those that test positive for the virus (Fegan & Clifford, 2001; Motte et al., 2003), as well as the development of specific pathogen free (SPF) shrimp stocks of P. vannamei and P. stylirostris (Lightner, 1996b; 2005; Lotz et al., 1995; Pruder et al., 1995; Wyban 1992). The latter has proven to be the most successful husbandry practice for the prevention and control of IHHN (Jaenike et al., 1992; Lightner, 2005; Pruder et al., 1995). Unfortunately, there is a misconception in the industry that SPF is a genetic trait rather than a condition of health status (Lightner et al., 2009). The development of SPF P. vannamei that were free not only of IHHNV, but also of all the major known pathogens of penaeid shrimp, has resulted in the introduction of the species to Asia and to its surpassing P. monodon in 2005 as the dominant farmed shrimp species in Asia as well as the Americas where the SPF stocks were developed (FAO, 2006; Lightner, 2005; Lightner et al., 2009; Rosenberry, 2004).

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Anexo 16 (cont.)

3.

Sampling 3.1. Selection of individual specimens Suitable specimens for testing for infection by IHHNV are all life stages (eggs, larvae, PL, juveniles and adults) (Motte et al., 2003). While IHHNV may infect all life stages, infection severity, and hence virus load, may be below detection limits in spawned eggs and in the larval stages, so these life stages may not be suitable samples for IHHNV detection or certification for IHHN disease freedom. 3.2. Preservation of samples for submission For routine histology or molecular assays, and guidance on preservation of samples for the intended test method see Chapter 2.2.0. 3.3. Pooling of samples Samples taken for molecular tests may be combined as pooled samples representing no more than five specimens per pooled sample of juveniles, subadults and adults. However, for eggs, larvae and PL, pooling of larger numbers (e.g. ~150 or more eggs or larvae or 50–150 PL depending on their size/age) may be necessary to obtain sufficient sample material (extracted nucleic acid) to run a diagnostic assay. See also Chapter 2.2.0. 3.4. Best organs and tissues IHHNV infects tissues of ectodermal and mesodermal origin. The principal target tissues for IHHNV include connective tissue cells, the gills, haematopoietic nodules and haemocytes, ventral nerve cord and ganglia, antennal gland tubule epithelial cells, and lymphoid organ parenchymal cells (Lightner, 1996a; Lightner & Redman, 1998a). Hence, whole shrimp (e.g. larvae or PLs) or tissue samples containing the aforementioned target tissues are suitable for most tests using molecular methods. Haemolymph or excised pleopods may be collected and used for testing (usually for PCR, or dot-blot hybridisation with specific probes) when non-lethal testing of valuable broodstock is necessary (Lightner, 1996a; Lightner & Redman, 1998a). 3.5. Samples/tissues that are not suitable IHHNV is a systemic virus, and it does not replicate in enteric tissues (e.g. the hepatopancreas, the midgut, or its caeca). Hence, enteric tissues are inappropriate samples for detection of infection by IHHNV (Lightner, 1996a; 2011; Lightner & Redman, 1998a).

4.

Diagnostic methods 4.1. Field diagnostic methods 4.1.1.

Clinical signs

Certain cuticular deformities, specifically a deformed rostrum bent to the left or right, which may be presented by P. vannamei and P. stylirostris with RDS, are pathognomonic for infection by IHHNV (see Section 4.2.1.2). However, this clinical sign is not always apparent in shrimp populations chronically infected with IHHNV. As P. vannamei, P. stylirostris, and P. monodon can be infected by IHHNV and not present obvious signs of infection (e.g. they may show markedly reduced growth rates or ‘runting’), molecular tests are recommended when evidence of freedom from IHHN disease is required. 4.1.2.

Behavioural changes

In acute IHHN disease, P. stylirostris may present behavioural changes (see Section 4.2.1.1) but with RDS, no consistent behavioural changes have been reported for affected shrimp.

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Anexo 16 (cont.)

4.2. Clinical methods 4.2.1.

Gross pathology

4.2.1.1. IHHN disease in Penaeus stylirostris IHHNV often causes an acute disease with very high mortalities in juveniles of this species. Vertically infected larvae and early PL do not become diseased, but in approximately 35-day-old or older juveniles, gross signs of the disease may be observed, followed by mass mortalities. In horizontally infected juveniles, the incubation period and severity of the disease is somewhat size and/or age dependent, with young juveniles always being the most severely affected. Infected adults seldom show signs of the disease or mortalities (Bell & Lightner, 1984; 1987; Bondad-Reantaso et al., 2001; Brock et al., 1983; Brock & Main, 1994; Lightner, 1983; 1988; 1993; 1996a; 2011; Lightner et al., 1983a, 1983b). Gross signs are not IHHN specific, but juvenile P. stylirostris with acute IHHN show a marked reduction in food consumption, followed by changes in behaviour and appearance. Shrimp of this species with acute IHHN have been observed to rise slowly in culture tanks to the water surface, where they become motionless and then roll-over and slowly sink (ventral side up) to the tank bottom. Shrimp exhibiting this behaviour may repeat the process for several hours until they become too weak to continue, or until they are attacked and cannibalised by their healthier siblings. Penaeus stylirostris at this stage of infection often have white or buff-coloured spots (which differ in appearance and location from the white spots that sometimes occur in shrimp with WSSV infections) in the cuticular epidermis, especially at the junction of the tergal plates of the abdomen, giving such shrimp a mottled appearance. This mottling later fades in moribund P. stylirostris as such individuals become more bluish. In P. stylirostris and P. monodon with terminal-phase IHHNV infections, moribund shrimp are often distinctly bluish in colour, with opaque abdominal musculature (Bondad-Reantaso et al., 2001; Lightner, 1983; 1988; 1993; 1996a; 2011; Lightner et al., 1983a; 1983b). 4.2.1.2. IHHN disease in Penaeus vannamei RDS, a chronic form of IHHN disease, occurs in P. vannamei as a result of IHHNV infection. The severity and prevalence of RDS in infected populations of juvenile or older P. vannamei may be related to infection during the larval or early PL stages. RDS has also been reported in cultured stocks of P. stylirostris and P. monodon. Juvenile shrimp with RDS may display a bent (45° to 90 bend to left or right) or otherwise deformed rostrum, a deformed sixth abdominal segment, wrinkled antennal flagella, cuticular roughness, ‘bubble-heads’, and other cuticular deformities. Populations of juvenile shrimp with RDS display disparate growth with a wide distribution of sizes and many smaller than expected (‘runted’) shrimp. The coefficient of variation (CV = the standard deviation divided by the mean of different size groups within a population) for populations with RDS is typically greater than 30% and may approach 90%, while IHHNV-free (and thus RDS-free) populations of juvenile P. vannamei and P. stylirostris usually show CVs of 10–30% (Bray et al., 1994; Brock & Lightner, 1990; Brock et al., 1983; Brock & Main, 1994; Browdy et al., 1993; Carr et al., 1996; Lightner, 1996a; Primavera & Quinitio, 2000; Pruder et al., 1995). 4.2.2.

Clinical chemistry

Not applicable. 4.2.3.

Microscopic pathology

Acute IHHNV infections in P. stylirostris can be readily diagnosed using routine haematoxylin and eosin (H&E) stained histological methods (see Section 4.2.6). Chronic IHHNV infections and RDS are much more difficult to diagnose using routine H&E histological methods. For diagnosis of chronic infections, the use of molecular methods are recommended for IHHNV detection (e.g. by PCR or application of IHHNV-specific DNA probes to dot-blot hybridisation tests or ISH of histological sections). Histological demonstration of prominent intranuclear, Cowdry type A inclusion bodies provides a provisional diagnosis of IHHNV infection. These characteristic IHHN inclusion bodies are eosinophilic and often haloed (with H&E stains of tissues preserved with fixatives that contain acetic acid, such as Davidson’s AFA and Bouin’s solution) (Bell & Lightner, 1988; Lightner, 1996a), intranuclear inclusion bodies within chromatinmarginated, hypertrophied nuclei of cells in tissues of ectodermal (epidermis, hypodermal epithelium of foreand hindgut, nerve cord and nerve ganglia) and mesodermal origin (haematopoietic organs, antennal gland, gonads, lymphoid organ, and connective tissue). Intranuclear inclusion bodies caused by IHHNV may be easily confused with developing intranuclear inclusion bodies caused by WSSV infection. ISH assay (see Section 4.3.1.2.3 of this chapter) of such sections with a specific DNA probe to IHHNV provides a definitive diagnosis of IHHNV infection (Lightner, 1996a; 2011; Lightner & Redman, 1998a).

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Anexo 16 (cont.)

4.2.4.

Wet mounts

No reliable methods have been developed for direct microscopic pathology. 4.2.5.

Smears

Not applicable. 4.2.6.

Fixed sections

Histopathology: histology may be used to provide a definitive diagnosis of IHHNV infection. Because 10% buffered formalin and other fixatives provide, at best, only fair fixation of the shrimp, the use of Davidson’s fixative (containing 33% ethyl alcohol [95%], 22% formalin [approximately 37% formaldehyde], 11.5% glacial acetic acid and 33.5% distilled or tap water) is highly recommended for all routine histological studies of shrimp (Bell & Lightner, 1988; Lightner, 1996a). To obtain the best results, dead shrimp should not be used. Only live, moribund, or compromised shrimp should be selected for fixation and histological examination. Selected shrimp are killed by injection of fixative directly into the hepatopancreas; the cuticle over the cephalothorax and abdomen just lateral to the dorsal midline is opened with fine-pointed surgical scissors to enhance fixative penetration (the abdomen may be removed and discarded), the whole shrimp (or cephalothorax less the abdomen) is immersed in fixative for from 24 to no more than 48 hours, and then transferred to 70% ethyl alcohol for storage. After transfer to 70% ethyl alcohol, fixed specimens may be transported (via post or courier to the diagnostic laboratory) by wrapping in cloth or a paper towel saturated with 70% ethyl alcohol and packed in leak-proof plastic bags (see Section 4.2.3). In-situ hybridisation (see Section 4.3.1.2.3 below). 4.2.7.

Electron microscopy/cytopathology

Electron microscopy is not recommended for routine diagnosis of IHHNV. 4.3. Agent detection and identification methods 4.3.1.

Direct detection methods

4.3.1.1. Microscopic methods 4.3.1.1.1. Wet mounts See Section 4.2.4. 4.3.1.1.2. Smears See Section 4.2.5. 4.3.1.1.3. Fixed sections See section 4.2.6. 4.3.1.2. Agent isolation and identification 4.3.1.2.1. Cell culture/artificial media IHHNV has not been grown in vitro. No crustacean cell lines exist (Lightner, 1996a; Lightner & Redman, 1998a: 1998b). 4.3.1.2.2. Antibody-based antigen detection methods None has been successfully developed.

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Anexo 16 (cont.)

4.3.1.2.3. Molecular techniques Direct detection methods using DNA probes specific for IHHNV are available in dot-blot and ISH formats. PCR tests for IHHNV have been developed and a number of methods and commercial products using these methods are readily available. DNA probes for dot-blot and ISH applications: gene probe and PCR methods provide greater diagnostic sensitivity than do more traditional techniques for IHHN diagnosis that employ classic histological approaches. Furthermore, these methods have the added advantage of being applicable to non-lethal testing of valuable broodstock shrimp. A haemolymph sample may be taken with a tuberculin syringe, or an appendage (a pleopod for example) may be biopsied (Bell et al., 1990), and used as the sample for a direct dot-blot test. Dot-blot hybridisation procedure for IHHNV: the probe is labelled with a non-radioactive label, digoxigenin11-dUTP (DIG-11-dUTP). The system using DIG to label nucleic acid probes was developed by Boehringer Mannheim Biochemicals (this company is now owned by Roche Diagnostic Corporation), which is described in the Roche DIG Nonradioactive Labeling and Detection Product Selection Guide and DIG Application Manual for Filter HybridizationTM System User’s Guide for Membrane Hybridization and from Boehringer Mannheim’s 1 Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual (2006a; 2006b). The protocols given below use a DIG-labelled probe to IHHNV produced by one of several methods. Probes may be produced using a fragment of cloned IHHNV DNA as the template by the random primed labelling method (Lightner, 1996a; Mari et al., 1993). An alternative method for producing DIG-labelled probes uses specific primers from the cloned IHHNV DNA and the Roche PCR DIG Probe Synthesis KitTM. Dot-blot hybridisation procedure: the dot-blot hybridisation method given below uses a DIG-labelled DNA probe for IHHNV and generally follows the methods outlined in Mari et al. (1993) and Lightner (1996a). Formulas for the required reagents are given after the protocols. i)

Prepare a positively charged nylon membrane (Roche Diagnostics Cat. No. 1-209-299 or equivalent): cut pieces to fit samples and controls and mark with soft-lead pencil making 1 cm squares for each sample. Include a positive and a negative control on each filter. Lay out on to a piece of filter paper (Whatman 3MM).

ii)

If necessary, dilute samples to be assayed in TE (Tris/EDTA [ethylene diamine tetra-acetic acid]) buffer plus 50 µg ml–1 salmon sperm DNA, using 1 µl sample in 9 µl buffer in 1.5 ml microcentrifuge tubes. Samples for dot-blots can be haemolymph, tissues homogenised in TN (Tris/NaCl: 0.4 M NaCl and 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) buffer, or extracted DNA in 10 mM Tris/HCl.

iii)

Boil samples for 10 minutes and quench on ice for 5 minutes. Briefly microfuge samples in the cold to bring down all liquid and to pellet any coagulated protein. Keep on ice until samples are dotted on to the membrane.

iv)

Dot 1–3 µl of each sample on to an appropriate place on the filters. Allow to air-dry and then fix samples on to the membrane by baking at 80°C for 30 minutes or by UV cross-linking using a DNA transilluminator for 3 minutes.

v)

Adjust a water bath to 68°C and prepare the prehybridisation solution. For a 10 × 15 cm membrane, prepare 8 ml per membrane. Set a stirring hot plate to ‘low’ and stir while warming the solution for 30 minutes until the blocking agent has dissolved and the solution is cloudy. Also, prepare some heatseal bags that are slightly larger in size than the membrane: five to six bags will be needed per membrane.

vi)

Remove membranes from the oven or transilluminator and put into a heat-seal bag with 4 ml per membrane of prehybridisation solution. Seal the bags and put into a 68°C water bath for 0.5–1 hour.

vii)

Boil the DIG-labelled probe for 10 minutes, quench on ice and then microfuge in the cold to bring all the liquid down in the microcentrifuge tube. Keep on ice. Remove the prehybridisation solution from the bags. Add 2 ml of fresh prehybridisation solution to each bag and then add the correct, predetermined amount of DIG-labelled probe to each, mixing well as it is being added. Seal the bags, place back in the 68°C water bath and incubate for 8–12 hours.

                                                             1

Reference to specific commercial products as examples does not imply their endorsement by the OIE. This applies to all commercial products referred to in this Aquatic Manual.

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Anexo 16 (cont.)

viii) Wash membranes well with: 2 × standard saline citrate (SSC)/0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS) 0.1 × SSC/0.1% SDS (use 4 ml/filter and seal in bags) Buffer I Buffer II Buffer I (Buffers are prepared ahead of time).



5 minutes at room temperature



15 minutes at 68°C

1× 1× 1×

5 minutes at room temperature 30 minutes at room temperature 5 minutes at room temperature

ix)

React the membrane in bags with anti-DIG AP conjugate (Roche Diagnostics 1-093-274) diluted 1/5000 in Buffer I. Use 3 ml per membrane; incubate for 30–45 minutes at room temperature on a shaker platform.

x)

Wash membrane well with: Buffer I Buffer III

2× 1×

15 minutes at room temperature 5 minutes at room temperature

xi)

Develop the membranes in bags using 3 ml per membrane of development solution (nitroblue tetrazolium salt [NBT]/X-phosphate in Buffer III) made up just prior to use. React in the dark at room temperature for 1–2 hours. Stop the reactions in Buffer IV and dry the membranes on 3MM filter paper.

xii)

Photograph the results (colour fades over time).

xiii) Store dry membranes in heat-seal bags. In-situ hybridisation (ISH) procedure: the ISH method given below uses a DIG-labelled DNA probe for IHHNV and generally follows the methods outlined in Mari et al. (1993) and Lightner (1996a). Formulas for the required reagents are given after the protocols. i)

Embed tissue in paraffin and cut sections at 4–6 µm thickness. Place sections on to positively charged microscope slides (do not put gelatine in water to float sections; just use water).

ii)

Put slides in a slide rack, such as a Tissue-Tek rack. Heat the slides in an oven for 45 minutes at 60°C. In the staining centre, rehydrate the tissue as follows: Xylene (or suitable substitute) Absolute alcohol 95% alcohol 80% alcohol 50% alcohol Distilled water

3× 5 minutes each 2× 1 minute each 2× 10 dips each 2× 10 dips each 1× 10 dips six rinses (do not let slides dry out)

iii)

Wash the slides for 5 minutes in phosphate buffered saline (PBS or Tris/NaCl/EDTA [TNE] buffer). Prepare fresh proteinase K at 100 µg ml–1 in PBS (or TNE). Place slides flat in a humid chamber, pipette on 500 µl of the proteinase K solution and incubate for 10–15 minutes at 37°C. Drain fluid onto blotting paper.

iv)

Return slides to slide rack. Fix sections in 0.4% cold formaldehyde for 5 minutes at room temperature.

v)

Incubate slides in 2 × SSC for 5 minutes at room temperature.

vi)

With slides flat, add 0.5–1 ml prehybridisation buffer and incubate in a humid chamber for 15– 30 minutes at 37°C.

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Anexo 16 (cont.)

vii)

Boil the DIG-labelled probe for 10 minutes and quench on ice; spin briefly in the cold and keep on ice. Dilute the probe to 25 ng ml–1 in prehybridisation solution and cover the tissue with 250 µl of the solution. Incubate the slides for 2–4 hours at 42°C or overnight at 37°C in a humid chamber. Drain fluid onto blotting paper. During this incubation, pre-warm the wash buffers at 37°C.

viii) Place slides in slide rack. Wash the slides as follows: 2 × SSC 1 × SSC 0.5 × SSC

2× 2× 2×

5–30 minutes at 37°C 5 minutes at 37°C 5 minutes at 37°C

ix)

Wash the slides for 5 minutes in Buffer I at room temperature. Put the slides flat in a humid chamber and block with 0.5 ml per slide of Buffer II. Incubate for 15 minutes at 37°C. Drain the fluid on to blotting paper.

x)

Dilute the anti-DIG AP conjugate (Roche Applied Science cat. 10686322) 1/1000 in Buffer II (1 µl anti-DIG AP per 1 ml buffer). Cover tissue with 500 µl of diluted conjugate and incubate in a humid chamber for 30 minutes at 37°C.

xi)

Place the slides in a slide rack. Wash in Buffer I twice for 5–10 minutes each time at room temperature. Wash once with Buffer III for 5–10 minutes.

xii)

Prepare the development solution by first adding 4.5 µl NBT per 1 ml buffer III. Mix well. Then add 3.5 µl X-phosphate per ml of solution and mix well. Pipette on 500 µl per slide and incubate in a humid chamber in the dark for 2–3 hours at room temperature.

xiii) Stop the reaction by returning the slides to a slide rack and washing in Buffer IV for 15 minutes at room temperature. xiv) Counterstain the slides by dipping for 5 minutes in 0.5% aqueous Bismarck brown Y. xv)

Dehydrate the slides in the staining centre as follows: 95% alcohol Absolute alcohol Xylene (or suitable substitute)

3× 3× 4×

10 dips each 10 dips each 10 dips each

Do not allow the slides to dry out – leave them in the last xylene (or xylene substitute) container until ready for cover-slips. xvi) Mount with cover-slips and mounting medium (Permount). xvii) Examine the slides under bright-field for a dark-blue or black precipitate that marks sites where IHHNV DNA is present. Pathodiagnostic intranuclear Cowdry type A inclusions are well marked with the probe. Also often marked are host cell nuclei without obvious inclusions, cytoplasmic inclusions, and accumulation of free virus in the tissue spaces and haemolymph. NOTE: Always run a known positive and negative control. Reagent formulas for ISH method: i)

10 × phosphate buffered saline NaCl KH2PO4

160 g 4g

Na2HPO4

23 g

KCl DD H2O

4g 1950 ml (qs to 2 litres) Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 16 (cont.)

pH to 8.2 with NaOH; autoclave to sterilise; store at room temperature. To make 1 × PBS, dilute 100 ml 10 × PBS in 900 ml DD H2O; Filter 1 × solution through a 0.45 µm filter; store at 4°C. ii)

10 × Tris/NaCl/EDTA (TNE) buffer Tris base NaCl EDTA DD H2O

60.57 g 5.84 g 3.72 g 900 ml (qs to 1 litre)

pH to 7.4 with concentrated or 5 M HCl. To make 1 × TNE, dilute 100 ml 10 × TNE in 900 ml DD H2O; Filter 1 × solution through a 0.45 µm filter; store at 4°C. iii)

Proteinase K, 100 µg ml–1 (prepare just prior to use) PBS 10 ml 1 × PBS Proteinase K 1 mg

iv)

0.4% formaldehyde 37% formaldehyde DD H2O

5.4 ml 500 ml

Store at 4°C; can be reused up to four times before discarding. v)

Prehybridisation buffer (50 ml final volume) 4 × SSC 10 ml 20 × SSC 50% formamide 25 ml 100% formamide 1 × Denhardt’s 2.5 ml 20 × Denhardt’s 5% dextran sulphate 10 ml 25% dextran sulphate Warm to 60°C Boil 2.5 ml of 10 mg ml–1 salmon sperm DNA and add to buffer for final concentration of 0.5 mg ml–1 salmon sperm DNA; store at 4°C.

vi)

20 × SSC buffer 3M NaCl 0.3 M Na3C6H5O7.2H2O

175.32 g NaCl 88.23 g Na citrate.2H2O

DD H2O

1000 ml (qs)

pH to 7.0; autoclave; store at 4°C. To make 2 × SSC, dilute 100 ml 20 × SSC in 900 ml DD H2O; To make 1 × SSC, dilute 50 ml 20 × SSC in 950 ml DD H2O; To make 0.5 × SSC, dilute 50 ml 20 × SSC in 1950 ml DD H2O. Filter solutions through a 0.45 µm filter; store at 4°C. vii)

20 × Denhardt’s solution BSA (Fraction V) Ficoll 400 PVP 360 DD H2O

0.4 g bovine serum albumin 0.4 g Ficoll 0.4 g polyvinylpyrollidine 100 ml

Filter solutions through a 0.45 µm filter; store at 4°C. Aliquot 2.5 ml into small tubes and store frozen. viii) 25% dextran sulphate Dextran sulphate DD H2O

25 g 100 ml

Mix to dissolve; store frozen in 10 ml aliquots. ix)

Salmon sperm DNA (10 mg ml–1) Salmon sperm DNA DD H2O

0.25 g 25 ml

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Anexo 16 (cont.)

To prepare, warm the water and slowly add the DNA with stirring until completely dissolved; boil for 10 minutes; shear the DNA by pushing through an 18-gauge needle several times; aliquot 2.5 ml into small tubes and store frozen; boil for 10 minutes just before using to facilitate mixing in the buffer. x)

10 × Buffer I 1 M Tris/HCl 1.5 M NaCl DD H2O

121.1 g Tris base 87.7 g NaCl 1000 ml (qs)

pH to 7.5 with HCl. Autoclave; store at 4°C. To make 1 × Buffer I, dilute 100 ml of 10 × stock in 900 ml DD H2O. Filter through a 0.45 µm filter; store at 4°C. xi)

Buffer II (blocking buffer) Blocking reagent Buffer I Store at 4°C for up to 2 weeks.

xii)

0.25 g Blocking reagent (Roche Diagnostics 1-096176) 50 ml 1 × Buffer I

Buffer III 100 mM Tris/HCl 100 mM NaCl DD H2O

1.21 g Tris base 0.58 g NaCl 100 ml (qs)

pH to 9.5 with HCl Then add: 50 mM MgCl2

1.02 g MgCl2.6H2O

Filter through a 0.45 µm filter; store at 4°C. xiii) 10% polyvinyl alcohol (PVA) Polyvinyl alcohol DD H2O

10 g 100 ml

To prepare, slowly add PVA to water while stirring on low heat. (It takes 2–3 hours for PVA to go into solution.) Dispense 10 ml per tube and store frozen at –20°C. xiv) Development solution Mix 90 ml Buffer III with 10 ml of 10% PVA. Store at 4°C. Just prior to use, for each 1 ml of Buffer III with PVA add: 4.5 µl NBT 3.5 µl X-phosphate

xv)

75 mg NBT ml–1 in 70% dimethylformamide (Roche Diagnostics 1-383-213) 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate, toluidine salt (50 mg ml–1 in dimethylformamide) (Roche Diagnostics 1-383-221)

Buffer IV 10 mM Tris/HCl 1 mM EDTA

1.21 g Tris base 0.37 g EDTA.2H2O (disodium salt)

DD H2O

1000 ml

pH to 8.0 with HCl. Filter through a 0.45 µm filter; store at 4°C. xvi) 0.5% Bismarck Brown Y Bismarck Brown Y DD H2O

2.5 g 500 ml

Dissolve the stain in water. Filter through a Whatman No. 1 filter; store at room temperature.

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Anexo 16 (cont.)

Polymerase chain reaction for IHHNV: several single-step PCR methods (Krabsetsve et al., 2004; Nunan at al., 2000; Shike et al., 2000; Tang et al., 2000; 2007; Tang & Lightner 2001), and a number of commercial PCR kits are available for IHHNV detection. Nested methods are also available from commercial sources. There are multiple geographical variants of IHHNV, some of which are not detected by all of the available methods for IHHNV. Two primer sets, 392F/R and 389F/R, are the most suitable for detecting all the known genetic variants of IHHNV (Krabsetsve et al., 2004; Tang & Lightner, 2002), including types 3A and 3B, which are inserted into the genome of certain geographic stocks of P. monodon from the western IndoPacific, East Africa, Australia and India (Duda & Palumbi, 1999; Tang & Lightner, 2006; Tang et al., 2007; Saksmerprome et al., 2011). New PCR primers have been developed that can detect the IHHN viral sequence but do not react with IHHNV-related sequences present in the P. monodon stocks from Africa, Australia (Tang et al., 2007), or Thailand (Saksmerprome et al., 2011). Primer set 309F/R amplifies only a segment from IHHNV types 1 and 2 (the infectious forms of IHHNV), but not types 3A and 3B, which are non-infectious and part of the P. monodon genome (Tang & Lightner, 2006; Tang et al., 2007). Primer set MG831F/R reacts only with types 3A and 3B, which are non-infectious and part of the P. monodon genome (Tang et al., 2007). Hence, confirmation of unexpected positive and/or negative PCR results for IHHNV with a second primer set, or use of another diagnostic method (i.e. PCR using primers from another region of the genome, real-time PCR, bioassay, ISH) is highly recommended.

Table 4.1. Recommended primer sets for one-step PCR detection of IHHNV Primer

Product

Sequence

G+C%/Temp.

GenBank & References

389F

389 bp

5’-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3’

50%/72°C

AF218266

5’-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3’

45%/71°C

(Tang et al., 2000)

5’-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3’

50%/68°C

AF218266

5’-TCG-TAC-TGG-CTG-TTC-ATC-3’

55%/63°C

(Nunan et al., 2000 2001)

5’-GGG-CGA-ACC-AGA-ATC-ACT-TA-3’

50%/68°C

AF218266

5’-ATC-CGG-AGG-AAT-CTG-ATG-TG-3’

50%/71°C

(Tang et al., 2000; 2007)

5’-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A-3’

36%/68°C

AF218266

5’-TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A-3’

40%/69°C

(Tang et al., 2007)

5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’

45%/58°C

DQ228358

5’-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGA-CT-3’

55%/62°C

(Tang et al., 2007)

389R 77012F

356 bp

77353R 392F

392 bp

392R 309F

309 bp

309R MG831F

831 bp

MG831R

NOTE: Primers 389F/R and 392F/R described above are from the nonstructural protein-coding region (ORF 1) of the IHHNV genome. Primers 77353/77012 are from a region in between the nonstructural and the structural (coat protein) protein-coding regions of the genome. In the event that results are ambiguous using the 389F/R ‘universal’ primer set, it is recommended to use primers from a different region of the genome for confirmatory testing. In this case, that would mean using primers 77012/77353 or the 392F/R primer sets and follow up with sequencing of PCR amplicons for confirmation. General PCR method for IHHNV: the PCR method described below for IHHNV generally follows the methods outlined in Nunan et al. (2000). Cumulative experience with the technique has led to modifications with respect to template (DNA extraction of clinical specimens), choice of primers (Table 4.1), and volume of reaction. i)

Use as a template, the DNA extracted from ground tissue homogenate (TN buffer, 0.4 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.4) or haemolymph (collected with a small amount of 10% sodium citrate) or from tissue or haemolymph that was fixed in 95% ethanol and then dried. A control consisting of tissue or haemolymph from known negative animals should be included during the DNA extraction step. The DNA can be extracted by a variety of methods, but excellent results have been obtained using kits from Roche Diagnostics (Cat. No. 1-796-828) or Qiagen (Cat. No. 51304). Other DNA extraction kits include QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), MagMax™ Nucelic Acid kits (Life Technologies), or [email protected] 16 Cell LEV DNA Purification Kit (Promega), or reagents from Gibco Life Sciences DNazol Cat. No. 10503-027 (Life Technologies). Spectrophotometric readings of the final DNA will indicate the purity of the DNA and the amount of total DNA extracted from the sample. Use 1–5 µl of extracted DNA per 50 µl reaction volume.

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Anexo 16 (cont.)

ii)

The following controls should be included in every PCR assay for IHHNV: a) DNA from a known negative tissue sample; b) DNA from a known positive sample (either from tissue or haemolymph or from a plasmid clone that contains the fragment that the specific set of primers amplifies; and c) a ‘no template’ control.

iii)

Use as primers, primers 389F and 389R, which elicit a band 389 bp in size from IHHNV-infected material, or primers 77012F and 77353R, which elicit a band 356 bp in size from IHHNV-infected material. Prepare primers at 100 ng µl–1 in distilled water. Keep frozen at –70°C.

iv)

Use a ‘hot start’ method for the polymerase: if Applied Biosystem’s AmpliTaq Gold is used, this involves a 5-minute step at 95°C to denature DNA prior to the primers binding and activation of the enzyme. This programme is then linked to the cycling programme (35 cycles) and an extension programme. The programme is set as follows: Hot start Linked to

v)

Programme 1 Programme 2

Linked to

Programme 3

5 minutes 95°C 30 seconds 95°C 30 seconds 55°C 1 minute 72°C 7 minutes 72°C

Linked to

Programme 4

4°C until off

35 cycles

Prepare a ‘master mix’ consisting of water, 10 × PCR buffer, the four dNTPs, the two primers, MgCl2, AmpliTaq Gold and water (assume use of 1 µl of template; if using more, adjust water accordingly). Add mix to each tube. Use thin-walled tubes designed for PCR. Always run a positive and a negative control. ‘Master Mix’: DD H2O

32.5 µl × number of samples

10 × PCR buffer 10 mM dTTP 10 mM dATP 10 mM dCTP 10 mM dGTP 25 mM MgCl2

5 µl × number of samples 1 µl × number of samples 1 µl × number of samples 1 µl × number of samples 1 µl × number of samples 4 µl × number of samples

Forward primer (100 ng µl–1)

1.5 µl × number of samples

µl–1)

1.5 µl × number of samples

Reverse primer (100 ng AmpliTaq Gold

0.5 µl × number of samples

Vortex this solution to mix all reagents well; keep on ice. NOTE: The volume of the PCR reaction may be modified. Previously, the PCR reactions for IHHNV were run in 100 µl volumes, but it is not necessary to use that amount of reagents, therefore 50 µl volumes are described in this procedure. Likewise, the PCR reactions can also be run in volumes as small as 25 µl. To do this, increase or decrease the volume of the reagents accordingly. vi)

For a 50 µl reaction mix, add 49 µl Master Mix to each tube and then add 1 µl of the sample to be tested.

vii)

Vortex each tube, spin quickly to bring down all liquid. If the thermal cycler does not have a heated lid to prevent condensation, then carefully overlay the top of each sample with 25–50 µl mineral oil and re-cap the tubes. Insert tubes into the thermal cycler and start programme 1 (‘hot start’), which is linked to cycling, extension and soak cycles.

viii) If mineral oil was used, recover samples from under the mineral oil using a pipette set at 50 µl and transfer to a fresh tube. Using the long-tipped pipette tips (designed for loading gels) results in less oil being carried over with the sample.

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77 

Anexo 16 (cont.)

ix)

Run 10 µl of the sample in a 1.5% agarose gel (containing 0.5 µg ml–1 ethidium bromide to stain the DNA). Look for the 389 bp band (if using primers 389F and 389R) or for the 356 bp band (if using primers 77012F and 77353R). Bands are not always seen, as it is necessary to have at least 10 ng DNA µl–1 to see DNA in a gel. A Southern transfer of the gel or a dot-blot can be run for more sensitive detection. The DNA can also be precipitated (0.3 M sodium acetate and 2.5 volumes 100% ethanol, –70°C, for 1–3 hours, centrifuge for 20 minutes) and resuspended in 1/10th volume (i.e. 4 µl) TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) or water and either re-run in the gel or tested in a dot-blot.

Real-time PCR (qPCR) method for IHHNV: qPCR methods have been developed for the detection of IHHNV. These methods offer extraordinary sensitivity that can detect a single copy of the target sequence from the IHHNV genome (Dhar et al., 2001; Tang & Lightner, 2001). The qPCR method using TaqMan chemistry described below for IHHNV generally follows the method used in Tang & Lightner (2001). i)

The PCR primers and TaqMan probe are selected from a region of the IHHNV genomic sequence (GenBank AF218266) that encodes for non-structural protein. The primers and TaqMan probe are designed by the Primer Express software (Applied Biosystems). The upstream (IHHNV1608F) and downstream (IHHNV1688R) primer sequences are: 5’-TAC-TCC-GGA-CAC-CCA-ACC-A-3’ and 5’GGC-TCT-GGC-AGC-AAA-GGT-AA-3’, respectively. The TaqMan probe (5’-ACC-AGA-CAT-AGAGCT-ACA-ATC-CTC-GCC-TAT-TTG-3’), which corresponds to the region from nucleotide 1632 to 1644, is synthesised and labelled with fluorescent dyes 5-carboxyfluoroscein (FAM) on the 5’ end and N,N,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) on the 3’ end (Applied Biosystems, part no. 450025).

ii)

Preparation of DNA template: the extraction and purification of DNA template is the same as that described in the section of traditional PCR.

iii)

The qPCR reaction mixture contains: TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, part no. 4324018), 0.3 µM of each primers, 0.15 µM of TaqMan probe, 5–50 ng DNA, and water in a reaction volume of 25 µl. For optimal results, the reaction mixture should be vortexed and mixed well.

iv)

Amplification is performed with the GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems; ABI PRISM 7000, 7300, or 7500 or equivalent can also be used). The cycling profile is: activation of AmpliTaq Gold for 10 minutes at 95°C, followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 15 seconds and annealing/extension at 60°C for 1 minute. The levels of fluorescence are measured at the end of the annealing and extension step.

v)

At the end of the reaction, real-time fluorescence measurements will be taken with a built in chargecoupled device (CCD) camera. A threshold will be set to be above the baseline that begins to detect the increase in signal associated with an exponential increase of PCR product. Samples will be defined as negative if there is no Ct (threshold cycle) value is after 40 cycles. the Ct (threshold cycle) values exceed 40 cycles. Samples with a Ct value lower than 40 cycles are considered to be positive. To confirm the real-time PCR results, an aliquot of PCR product can be subjected to electrophoresis on a 4% ethidium bromide-agarose gel and photographed. An 81-bp DNA fragment can be visualised in the samples that are positive for IHHNV.

vi)

It is necessary to include a ‘no template’ control in each reaction run. This is to rule out the presence of fluorescence contaminants in the reaction mixture or in the heat block of the thermal cycler. A positive control should also be included, and it can be a plasmid containing the target sequence, or purified virions, or DNA from IHHNV-infected tissue. Sequencing: PCR products may be cloned and sequenced when necessary to confirm infection with IHHNV, to identify false positives or nonspecific amplification, or to distinguish the amplified product from the infectious form of the virus and demonstrate the presence of the insertion of non-infectious IHHNV genome in host DNA (Tang & Lighter, 2002; 2006).

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Anexo 16 (cont.)

Through PCR, IHHNV was detected in P. monodon from South-East Asia. Most of these IHHNV PCR assays also detected IHHNV-related sequences in P. monodon populations in Africa, Australia and Thailand (Tang & Lightner, 2006; Saksmerprome et al., 2011). To discriminate the IHHNV-related sequences from the actual virus, PCR assays using primers that detect the IHHN viral sequence and do not react with IHHNV-related sequences present in the P. monodon stocks from Africa or Australia (Tang et al., 2007), or Thailand (e.g. Saksmerprome et al., 2011) have been developed. PCR commercial kits are available for IHHNV diagnosis and can be acceptable provided they have been validated as fit for such purpose. The OIE validation procedure is described in Chapter 1.1.2 Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. 4.3.2.

Serological methods

Shrimp are invertebrate animals and do not produce antibodies. Therefore, serological methods for IHHN are not available.

5.

Rating of tests against purpose of use The methods currently available for surveillance, detection, and diagnosis of IHHNV are listed in Table 5.1. The designations used in the Table indicate: a = the method is the recommended method for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity; b = the method is a standard method with good diagnostic sensitivity and specificity; c = the method has application in some situations, but cost, accuracy, or other factors severely limits its application; and d = the method is presently not recommended and/or not available for this purpose. These are somewhat subjective as suitability involves issues of reliability, sensitivity, specificity and utility. Although not all of the tests listed as category a or b have undergone formal standardisation and validation, their routine nature and the fact that they have been used widely without dubious results, makes them acceptable

Table 5.1. IHHNV surveillance, detection and diagnostic methods Surveillance Method

Presumptive diagnosis

Confirmatory diagnosis

Larvae

PLs

Juveniles

Adults

Gross signs

d

d

d

d

d

d

Bioassay

d

d

d

d

c

c

Direct LM

d

d

d

d

d

d

Histopathology

d

d

c

c

a

b

Transmission EM

d

d

d

d

c

c

Antibody-based assays

d

d

d

c

d

d

DNA probes – in situ

d

d

b

b

a

a

PCR, qPCR

a

a

a

a

a

a

Sequence

d

d

d

d

d

a

PLs = postlarvae; LM = light microscopy; EM = electron microscopy; qPCR = real-time polymerase chain reaction.

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79 

Anexo 16 (cont.)

6.

Test(s) recommended for targeted surveillance to declare freedom from infectious hypodermal and haematopoietic necrosis As indicated in Table 5.1, PCR is the recommended method for targeted surveillance for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity. When investigating acute mortality episodes as part of a targeted surveillance programme, demonstration of pathognomonic IHHNV-induced lesions in the cuticular epithelium by histology (with or without confirmation by ISH with IHHNV-specific DNA probes) is a suitable method (Table 5.1).

7.

Corroborative diagnostic criteria 7.1. Definition of suspect case Poor hatching success of eggs, and poor survival and culture performance of the larval and PL stages (Motte et al., 2003) when broodstock are used from wild or farmed stocks where IHHNV is enzootic. In farmed stocks of P. stylirostris, juveniles, subadults and adults may show persistently high mortality rates. In P. vannamei, P. stylirostris, and possibly P. monodon, IHHNV-infected stocks may show poor and highly disparate growth, poor overall culture performance, and cuticular deformities, including especially bent rostrums and deformed sixth abdominal segments. Demonstration of eosinophilic to pale basophilic intranuclear inclusion bodies in the typical target tissues for IHHNV. As IHHNV intranuclear inclusion bodies are nearly identical in appearance to those occurring in the early stages of WSSV infections, their presence in tissue sections should be considered as a presumptive diagnosis of IHHNV until confirmed with a second test method, such as dot-blot or ISH with IHHNV-specific DNA probes or positive PCR test results for IHHNV. 7.2. Definition of confirmed case Any combination of at least two of the following four methods (with positive results):

8.



Positive dot-blot hybridisation test results for IHHNV.



ISH positive histological signal to IHHNV-type lesions.



PCR positive results for IHHNV.



Sequencing of PCR specific products may be required when the purpose is to determine the genotype of IHHNV.

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HYPODERMAL AND HEMATOPOIETIC

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Anexo 16 (cont.)

ZARAIN-HERZBERG M. & ASCENCIO-VALLE F. (2001). TAURA SINALOA. AQUACULTURE, 193, 1–9.

SYNDROME IN

MEXICO:

FOLLOW-UP STUDY IN SHRIMP FARMS OF

* * *

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85 

Anexo 17

CHAPTER 2.2.4.

NECROTISING HEPATOPANCREATITIS 1.

Scope Necrotising hepatopancreatitis (NHP) disease is caused by infection with Gram-negative, pleomorphic intracellular alpha-proteobacterium (Frelier et al., 1992; Lightner & Redman, 1994; Lightner et al., 1992; Loy et al., 1996a; 1996b). The principal host species in which necrotising hepatobacterium (NHPB) can cause significant disease outbreaks and mortalities are Penaeus vannamei and P. stylirostris (Del Río-Rodríguez et al., 2006; Frelier et al., 1993; Ibarra-Gámez et al., 2007; Lightner & Redman, 1994; Morales-Covarrubias et al., 2011a). NHP has four distinct phases: initial, acute, transition and chronic. In acute and transition-phase disease, pathognomonic lesions are typically present in histological sections of the hepatopancreas, while in the initial and chronic phases of the disease, there are no pathognomonic lesions, and molecular and antibody-based methods for NHPB detection are necessary for diagnosis (Morales-Covarrubias, 2010; Morales-Covarrubias et al., 2010; 2011b; Vincent & Lotz, 2005). Synonyms: necrotising hepatobacterium (NHPB) or NHP bacterium (NHPB); rickettsial-like organism (RLO).

2.

Disease information 2.1. Agent factors 2.1.1.

Aetiological agent, agent strains

NHPB is a pleomorphic, Gram-negative, intracytoplasmic bacterium. It is a member of the α-subclass of proteobacteria and remains unclassified (Frelier et al., 1992; Lightner & Redman, 1994; Loy et al., 1996a; 1996b). The predominant form is a rod-shaped rickettsial-like organism (0.25 × 0.9 µm), whereas the helical form (0.25 × 2–3.5 µm) possesses eight flagella at the basal apex (Frelier et al., 1992; Lightner & Redman, 1994; Loy et al., 1996a; 1996b). Genetic analysis of the NHPB associated with North and South American outbreaks of NHP suggest that the isolates are either identical or very closely related subspecies (Loy et al., 1996a; 1996b). 2.1.2.

Survival outside the host

No data. 2.1.3.

Stability of the agent

NHPB-infected tissues remain infectious after repeated cycles of freeze–thawing and after storage in 50% glycerine. NHPB frozen at –20°C –70°C and –80°C have been shown to retain infectivity in experimental transmission trials with Penaeus vannamei (Crabtree et al., 2006; Frelier et al., 1992). 2.1.4. Life cycle Not applicable. 2.2. Host factors 2.2.1.

Susceptible host species

Most penaeid species can be infected with NHPB, including the principal cultured species in Latin American, P. vannamei (Pacific white shrimp) and P. stylirostris (Pacific blue shrimp).

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Anexo 17 (cont.)

NHPB infections are most severe in P. vannamei where the intracellular bacterium can cause acute epizootics and mass mortality (>90%). In P. vannamei, the juvenile, subadult and broodstock life stages are the most severely affected (Johnson, 1990; Jory, 1997; Lightner, 1996; Morales-Covarrubias, 2010). NHPB causes chronic disease in P. vannamei, the main effects of which are slow growth, a soft cuticle and a flaccid body (Morales-Covarrubias, 2010; Morales-Covarrubias et al., 2011b). Outbreaks of NHP disease have been reported in P. aztecus (Johnson, 1990; Jory, 1997; Lightner, 1996; Morales-Covarrubias, 2010). NHP has also been seen in P.californiensis and P. setiferus (Frelier et al., 1995; Lightner, 1996). Penaeus setiferus is reportedly less susceptible to disease than P. vannamei (Frelier et al., 1995). In an NHP survey of the Gulf of Mexico, P.setiferus and P.duorarum in the vicinity of coastal prawn farms along the Yucatan and Campeche coast revealed no histological evidence of NHP (Del Río-Rodríguez et al., 2006). 2.2.2.

Susceptible stages of the host

NHPB has been demonstrated in juveniles, adults and broodstock of P. vannamei. 2.2.3.

Species or sub-population predilection

See Sections 2.2.1 and 2.2.2. 2.2.4.

Target organs and infected tissue

The target tissue is the hepatopancreas, with NHPB infection reported in all hepatopancreatic cell types. 2.2.5.

Persistent infection with lifelong carriers

Some members of P. vannamei populations that survive NHPB infections and/or epizootics may carry the intracellular bacteria for life and pass it on to other populations by horizontal transmission (Aranguren et al., 2006; Lightner, 2005; Morales-Covarrubias, 2008; 2010; Vincent & Lotz, 2005). Natural transmission of NHPB is thought to occur per os by cannibalism (Frelier et al., 1993; 1995; Johnson, 1990; Lightner, 2005; Morales-Covarrubias, 2010), although cohabitation and dissemination of NHPB via the water column may also play a role (Frelier et al., 1993; 1995). NHPB in faeces shed into pond water has also been suggested as a possible means of transmission (Aranguren et al., 2006; Briñez et al., 2003; MoralesCovarrubias et al., 2006). Outbreaks of disease are often preceded by prolonged periods of high water temperature (approximately 30°C) and salinity (up to 40 parts per thousand [ppt]) (Frelier et al., 1995; Lightner & Redman, 1994; Morales-Covarrubias, 2010; Morales-Covarrubias et al., 2010; 2011a; Vincent & Lotz, 2005). 2.2.6.

Vectors

No vectors are known in natural infections. 2.2.7.

Known or suspected wild aquatic animal carriers

NHPB is common in wild penaeid shrimp in Peru (P. vannamei) and Laguna Madre of Tamaulipas, Mexico (P. aztecus, P. duorarum and P. setiferus) (Aguirre-Guzman et al., 2010; Lightner & Redman, 1994).

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Anexo 17 (cont.)

2.3. Disease pattern 2.3.1.

Transmission mechanisms

Transmission of NHPB can be horizontal by cannibalism; transmission by contaminated water has been demonstrated (Aranguren et al., 2006; 2010; Frelier et al., 1993; Gracia-Valenzuela et al., 2011; MoralesCovarrubias et al., 2011b; Vincent et al., 2004). 2.3.2.

Prevalence

Some reported mean values for NHPB prevalence in wild stocks are between 5.6 and 15% in P. duorarum, and between 5 and 17% in P. aztecus collected from Carrizal and Carbonera, Laguna Madre of Tamaulipas, Mexico (Aguirre-Guzman et al., 2010); 0.77% in P. vannamei, and 0.43% in P. stylirostris collected from Tumbes Region, Peru (Lightner & Redman, 1994). Some reported mean values for NHPB prevalence in shrimp farms are betwwen 0.6% and 1.3% in P. vannamei collected from shrimp farms in Belize, Brazil, Guatemala, Honduras, Mexico, Nicaragua and Venezuela (Morales-Covarrubias et al., 2011a). 2.3.3.

Geographical distribution

NHPB appears to have a Western hemisphere distribution in both wild and cultured penaeid shrimp (AguirreGuzman et al., 2010; Del Río-Rodríguez et al., 2006). In the Western Hemisphere, NHPB is commonly found in cultured penaeid shrimp in Belize, Brazil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Honduras, Mexico, Nicaragua, Panama, Peru, United States of America, and Venezuela (Frelier et al., 1992; Ibarra-Gámez et al., 2007; Lightner, 1996; Morales-Covarrubias, 2010; Morales-Covarrubias et al., 2011a). 2.3.4.

Mortality and morbidity

In P. vannamei, infection by NHPB results in an acute, usually catastrophic disease with mortalities approaching 100%. 2.3.5.

Environmental factors

The replication rate of NHPB increases at lengthy periods of high temperatures (>29°C) and salinity changes (20–38%). In Mexico, NHPB has been detected at low prevalences (<7%) in shrimp farms in the months of April, May, July and August. However, in the months of September and October when temperatures are high during the day and low at night, high prevalences and mortality (>20%) are observed (Morales-Covarrubias, 2010). 2.4. Control and prevention Control The use of the antibiotics, oxytetracycline and florfenicol 50%, in medicated feeds every 8 hours for 10 days is probably the best NHP treatment currently available, particularly if disease is detected in the initial phase (Frelier et al., 1995; Morales-Covarrubias et al., 2011b). Prevention a)

Early detection (initial phase) of clinical NHP is important for successful treatment because of the potential for cannibalism to amplify and transmit the disease.

b)

Shrimp starvation and cannibalism of shrimps with NHPB, as well as positive conditions for NHPB cultivation, are important factors for NHPB propagation in P. vannamei.

c)

The use of hydrated lime (Ca(OH)2) to treat pond bottoms during pond preparation before stocking can help reduce NHP incidence.

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Anexo 17 (cont.)

d)

Preventive measures can include raking, tilling and removing sediments from the bottom of the ponds, prolonged sun drying of ponds and water distribution canals for several weeks, disinfection of fishing gear and other farm equipment using calcium hypochlorite, and drying and extensive liming of ponds.

e)

The use of specific pathogen-free (SPF) and female broodstock is an effective preventive measure.

2.4.1.

Vaccination

No scientifically confirmed reports. 2.4.2.

Chemotherapy

No scientifically confirmed reports. 2.4.3.

Immunostimulation

No scientifically confirmed reports. 2.4.4.

Resistance breeding

No scientifically confirmed reports. 2.4.5.

Restocking with resistant species

No scientifically confirmed reports. 2.4.6.

Blocking agents

No scientifically confirmed reports. 2.4.7.

Disinfection of eggs and larvae

NHPB has been demonstrated to be transmitted horizontally by cannibalism (Frelier et al., 1993; GraciaValenzuela et al., 2011; Johnson, 1990; Jory, 1997; Lightner, 1996; Lightner & Redman, 1994; Loy et al., 1996b; Morales-Covarrubias et al., 2011b; Vincent & Lotz, 2005; 2007). Disinfection of eggs and larvae is, therefore, a good management practice (Lee & O’Bryen, 2003) and is recommended for its potential to reduce NHPB contamination of spawned eggs and larvae (and contamination by other disease agents). 2.4.8.

General husbandry practices

Some husbandry practices have been successfully applied to the prevention of NHPB infections and disease. Among these has been the application of polymerase chain reaction (PCR) to prescreening of wild or pondreared broodstock.

3.

Sampling 3.1. Selection of individual specimens Suitable specimens for testing for infection by NHPB are life stages (postlarvae [PL], juveniles and adults). 3.2. Preservation of samples for submission For routine histology or molecular assays, and guidance on preservation of samples for the intended test method, see Chapter 2.2.0.

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Anexo 17 (cont.)

3.3. Pooling of samples Samples taken for molecular tests may be combined as pooled samples representing no more than five specimens per pooled sample of juveniles, sub adults and adults. However, for eggs, larvae and PL, pooling of larger numbers (e.g. ~150 or more eggs or larvae or 50–150 PL depending on their size/age) may be necessary to obtain sufficient sample material (extracted nucleic acid) to run a diagnostic assay. See also Chapter 2.2.0. 3.4. Best organs or tissues NHPB infects most enteric tissue. The principal target tissue for NHPB is hepatopancreas. Faeces may be collected and used for testing (usually by PCR, or dot-blot hybridisation with specific probes) when non-lethal testing of valuable broodstock is necessary (Bondad-Reantasco et al., 2001; Bradley-Dunlop et al., 2004; Briñez et al., 2003; Frelier et al., 1993; Lightner, 1996; Morales-Covarrubias et al., 2011b). 3.5. Samples/tissues those are not suitable NHPB are enteric bacteria and do not replicate in the midgut (enteric tissues), caeca (enteric tissues), connective tissue cells, the gills, haematopoietic nodules and haemocytes, ventral nerve cord and ganglia, antennal gland tubule epithelial cells, and lymphoid organ parenchymal cells.

4.

Diagnostic methods 4.1. Field diagnostic methods The prevalence and severity of NHPB infections may be ‘enhanced’ in a contained population by rearing shrimps in relatively crowded or stressful conditions. The ‘crowding stress’ factors may include high stocking densities, ablated, and marginal water quality (i.e. low dissolved oxygen, elevated water temperature, or elevated ammonia or nitrite) in the holding tank water. These conditions may encourage expression of lowgrade NHPB infections and the transmission of the agent from carriers to previously uninfected hosts in the population resulting in increased prevalence and severity of infections that can be more easily detected using the available diagnostic and detection methods for NHPB. 4.1.1.

Clinical signs

A wide range of gross signs can be used to indicate the possible presence of NHP. These include: lethargy, reduced food intake, atrophied hepatopancreas, anorexia and empty guts, noticeable reduced growth and poor length weight ratios (‘thin tails’); soft shells and flaccid bodies; black or darkened gills; heavy surface fouling by epicommensal organisms; bacterial shell disease, including ulcerative cuticle lesions or melanised appendage erosion; and expanded chromatophores resulting in the appearance of darkened edges in uropods and pleopods. 4.1.2.

Behavioural changes

In acute NHP disease, P. vannamei may present behavioural changes. 4.2. Clinical methods 4.2.1.

Gross pathology

NHPB often causes an acute disease with very high mortalities in young juveniles, adult and broodstock. In horizontally infected in young juveniles, adult and broodstock, the incubation period and severity of the disease is somewhat size and/or age dependent. Infected adults seldom show signs of the disease or mortalities (Aranguren et al., 2006; 2010; Bastos Gomes et al., 2010, Brock & Main, 1994; MoralesCovarrubias et al., 2011b). Gross signs are not NHP specific, but acute NHP show a marked reduction in food consumption, followed by changes in behaviour and appearance (see Section 4.1.1).

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Anexo 17 (cont.)

4.2.2.

Clinical chemistry

Not applicable. 4.2.3.

Microscopic pathology

Acute and chronic NHP in P. vannamei can be readily diagnosed using routine haematoxylin and eosin (H&E) stained histological methods (see Section 4.2.6). 4.2.3.1. Initial phase of necrotising hepatopancreatitis Initial NHPB infection is more difficult to diagnose using routine H&E histological methods. For diagnosis of initial infections, the use of molecular methods are recommended for NHPB detection (e.g. by PCR or application of NHPB-specific DNA probes to dot-blot hybridisation tests or in-situ hybridisation (ISH) of histological sections). 4.2.3.2. The acute phase of necrotising hepatopancreatitis The acute NHP disease is characterised by atrophied hepatopancreas with moderate atrophy of the tubule epithelia, presence of bacterial form cells and infiltrating haemocytes involving one or more of the tubules (multifocal encapsulations). Hypertrophic cells, individual ephitelial cells appeared to be separated from adjacent cells, undergo necrosis and desquamation in to tubular lumen and the tubular epithelial cell lipid content is variable. 4.2.3.3. Transition phase of necrotising hepatopancreatitis The transitional phase of NHP disease is characterised by haemocytic inflammation of the intertubular spaces in response to necrosis, cytolysis, and sloughing of hepatopancreas tubule epithelial cells. The hepatopancreas tubule epithelium is markedly atrophied, resulting in the formation of large oedematous (fluid filled or ‘watery’) areas in the hepatopancreas. Tubule epithelial cells within multifocal encapsulation are typically atrophied and reduced from simple columnar to cuboidal in morphology. They contain little or no stored lipid vacuoles, markedly reduced or no secretory vacuoles and masses of bacteria. At this phase haemocyte nodules were observed in the presence of masses of bacteria in the center of the nodule 4.2.3.4. Chronic phase of necrotising hepatopancreatitis In the chronic phase of NHP, tubular lesions, multifocal encapsulation and oedematous areas decline in abundance and severity and are replaced by infiltration and accumulation of haemocytes at the sites of necrosis. There are areas with fibrosis, few melanised and necrotic tubules and very low presence of hypertrophied cells with masses of bacteria in the cytoplasm and low haemocyte nodules. 4.2.4.

Wet mounts

Wet-mount squash examination of hepatopancreas (HP) tissue is generally conducted to detect presumptive NHP disease. The hepatopancreas may be atrophied and have any of the following characteristics: soft and watery; fluid filled center; paled with black stripes (melanised tubules); pale center instead of the normal orange coloration. Elevated mortality rates reaching over 90% can occur within 30 days of onset of clinical signs if not treated. For wet mount analysis the shrimp must be in the intermolt stage, and have not undergone a treatment that could alter the tubules. This technique is based on the deformation or tubular atrophy mainly of the apical region of the tubule. NHP disease has four phases: Phase Initial: low presence of tubular deformation (1–5 field–1 organism–1) and cell detachment. Acute phase: infiltration of haemocytes, increased numbers of deformed tubules (6–10 field–1 organism–1), encapsulation present in different regions of the sample, which is atrophied tubules surrounded by multiple layers of haemocytes.

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91 

Anexo 17 (cont.)

Transition phase: infiltration of haemocytes, increased numbers of deformed tubules (11–15 field–1 organism– 1), melanised tubules, necrotic tubules and a high level of encapsulation present in different regions of the sample. At this stage haemocyte nodules were observed in the presence of masses of bacteria in the centre of the nodule. Chronic phase: areas with fibrosis, few melanised and necrotic tubules and very low presence of hypertrophied cells with masses of bacteria in the cytoplasm. 4.2.5.

Smears

Not applicable. 4.2.6.

Electron microscopy/cytopathology

Not currently applicable for diagnostic purposes 4.3. Agent detection and identification methods 4.3.1.

Direct detection methods

4.3.1.1. Microscopic methods 4.3.1.1.1. Wet mounts See section 4.2.4 4.3.1.1.2. Smears Not applicable 4.3.1.1.3. Fixed sections See section 4.2.3. 4.3.1.1.4. Bioassay method Confirmation of NHPB infection may be accomplished by bioassay of NHPB-suspect animals with SPF juvenile P. vannamei serving as the indicator of the intracellular bacteria (Cock et al., 2009; Johnson, 1990; Lee & O’Bryen, 2003; Lightner, 2005). Oral protocols may be used. The oral method is relatively simple to perform and is accomplished by feeding chopped hepatopancreas of suspect shrimp to SPF juvenile P. vannamei in small tanks. The use of a negative control tank of indicator shrimp, which receive only a normal feed, is required. When the hepatopancreas feeding (per os) protocol is used to bioassay for NHPB, NHPpositive indicator shrimp (by gross signs and histopathology) are typically apparent within 3–4 days of initial exposure, and significant mortalities occur by 3–8 days after initial exposure. The negative control shrimp must remain negative (for at least 10–15 days) for gross or histological signs of NHP disease and unusual mortalities. 4.3.1.2. Agent isolation and identification 4.3.1.2.1. Cell culture/artificial media NHPB has not been grown in vitro. No crustacean cell lines exist (Morales-Covarrubias et al., 2010; Vincent & Lotz, 2007). 4.3.1.2.2. Antibody-based antigen detection methods Immunohistochemistry (IHC) tests using specific cDNA probes to NHP according to the methods described in Bradley-Dunlop et al. (2004) and Loy & Frelier (1996).

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92

Anexo 17 (cont.)

4.3.1.2.3. Molecular techniques ISH and reverse transcription (RT)-PCR tests for NHPB have been developed, and RT-PCR kits for NHPB are commercially available. PCR tests for NHP have been developed and a number of methods and and commercial products using these methods are available (Loy & Frelier, 1996; Loy et al., 1996b). Gene probes and PCR methods provide greater diagnostic sensitivity than do classic histological approaches to NHP diagnosis. Furthermore, these methods have the added advantage of being applicable to non-lethal testing of valuable broodstock shrimp. 4.3.1.2.3.1. DNA probes for ISH applications with non-radioactive cDNA probes Non-radioactive, DIG-labelled cDNA probes for NHPB may be produced in the laboratory. The ISH method of Loy & Frelier (1996) and Lightner (1996) provides greater diagnostic sensitivity than do more traditional methods for NHPB detection and diagnosis that employ classical histological methods (Johnson, 1990; Lightner, 1996; Morales-Covarrubias, 2010; Morales-Covarrubias et al., 2011b). The ISH assay of routine histological sections of acute-, transition- and chronic phase lesions in hepatopancreas with a specific DIGlabelled cDNA probe to NHPB, provides a definitive diagnosis of NHPB infection (Lightner, 1996; Loy & Frelier, 1996; Morales-Covarrubias et al., 2006). Pathognomonic NHPB-positive lesions display prominent blue to blue-black areas in the cytoplasm of affected cells when reacted with the cDNA probes. (See Chapter 2.2.2 IHHN for details of the ISH method, and Chapter 2.2.0 Section B.5.3.ii for detailed information on the use of Davidson’s AFA fixative.) 4.3.1.2.3.2. Reverse-transcription (RT)-PCR method Hepatopancreas and faeces may be assayed for NHPB using PCR. Primers designated as NHPF2: 5’-CGTTGG-AGG-TTC-GTC-CTT-CAGT-3’ and NHPR2: 5’-GCC-ATG-AGG-ACC-TGA-CAT-CAT-C-3’, amplify a 379 base pair (bp) designed against the GenBank accession number corresponding to the ribosomal 16S rRNA of NHPB, which amplify a 379 bp fragment (Nunan et al., 2008). The primer concentration (F2/R2) used for each is 0.31 μM. The cycling parameters are: Step 1: 95°C for 2 minutes, 1 cycle; Step 2: 60°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds and 95°C for 30 seconds, 25 cycles; Step 3: 60°C for 1 minute, 72°C for 2 minutes, 1 cycle; 4°C infinite hold. The RT-PCR method outlined below for NHPB generally follows the method used described in Nunan et al. (2008) Aranguren et al. (2010) with modifications by an OIE Reference Laboratory in the USA. i)

Preparation of RNA DNA template: RNA DNA can be extracted from 25-50 mg of fresh, frozen and ethanol-preserved hepatopancreas. Extraction of RNA DNA should be performed using commercially 2 available RNA DNA tissue extraction kits, such as the High Pure RNA Tissue Kit (Roche, Germany) and following the manufacturer’s procedures for production of quality RNA templates. Other DNA extraction kits include QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), MagMax™ Nucelic Acid kits (Life Technologies),or [email protected] 16 Cell LEV DNA Purification Kit (Promega).

ii)

The RT-PCR assay is carried out in solution, using final RNA concentration must be 10–1000 ng ml–1.

ii)

The following controls should be included in every RT-PCR assay for NHPB: a) known NHPB negative tissue sample; b) a known NHPB-positive sample (hepatopancreas); and c) a ‘no template’ control.

iii)

TM The GeneAmp® EZ rTth RNA PCR kit (Applied Bioscience, USA) PuReTaq Ready-To-Go PCR Bead (RTG beads, GE Healthcare) is used for all amplification reactions described here.

iv)

The optimised RT-PCR conditions (final concentrations in 50 25 μl total volume) for detection of NHPB in shrimp hepatopancreas samples are: primers (0.46 0.2 μM each), dNTPs (300 200 μM each), rTth DNA Taq polymerase (2.5 U 50 0.1 U μl–1), manganese acetate chloride (2.5 1.5 mM), in 5 × EZ buffer (25 mM Bicine, 57.5 mM potassium acetate, 40% [w/v] glycerol, pH 8.2) in 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl.

                                                             2

Reference to specific commercial products as examples does not imply their endorsement by the OIE. This applies to all commercial products referred to in this Aquatic Manual.

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93 

Anexo 17 (cont.)

v)

If the thermal cycler does not have a heated lid, then light mineral oil (50 μl) is overlaid on the top of the 50 25 μl reaction mixtures to prevent condensation or evaporation during thermal cycling.

vii)

The RNA template and all the reagents are combined and reverse transcription was allowed to proceed at 60°C for 30 minutes, followed for 2 minutes.

vi)

The cycling parameters are: Step 1: 95°C for 2 5 minutes, 1 cycle; Step 2: 60 95°C for 30 seconds, 72 60°C for 30 seconds and 95 72°C for 30 seconds, 25 35 cycles; Step 3: 60°C for 1 minute, 72°C for 2 minutes, 1 cycle; 4°C infinite hold. Note: The conditions should be optimised for each thermal cycler using known positive controls.

ix)

Details of the composition of the reagents and buffers used here may be found in Chapter 2.2.2 IHHN.

4.3.1.2.3.3. Real-time PCR method Real-time PCR methods have been developed for the detection of NHPB. These methods have the advantages of speed, specificity and sensitivity. The sensitivity of real-time PCR is ~100 copies of the target sequence from the NHPB genome (Aranguren et al., 2010; Vincent & Lotz, 2005). The real-time PCR method using TaqMan chemistry described below for NHPB generally follows the method used in Aranguren et al (2010). i)

The PCR primers and TaqMan probe were selected from the 16S, rRNA gene of NHPB (GenBank U65509) (Loy & Frelier., 1996). The primers and TaqMan probe were designed by the Primer Express software version 2.0 (Applied Biosystems). The upstream (NHP1300F) and downstream (NHP1366R) primer sequences are: 5’-CGT-TCA-CGG-GCC-TTG-TACAC-3’ and 5’-GCT-CAT-CGC-CTT-AAA-GAAAAG-ATA-A-3’, respectively. The TaqMan probe NHP: 5’-CCG-CCC-GTC-AAG-CCA-TGG-AA-3’, which corresponds to the region from nucleotides 1321–1340, is synthesised and labelled with fluorescent dyes 6-carboxyfluorescein (FAM) on the 5’ and N,N,N,Ntetramethyl- 6-carboxyrhodamine (TAMRA) on the 3’ end.

ii)

Preparation of RNA DNA template: the extraction and purification of RNA DNA template from hepatopancreas, is the same as that described in the section for traditional real-time PCR.

iii)

The real-time PCR reaction mixture contains: TaqMan One-step real-time PCR SuperMix (Quanta, Biosciences), 0.3 μM of each primer, 0.1 μM of TaqMan probe, 5–50 ng of RNA, and water in a reaction volume of 25 μl. For optimal results, the reaction mixture should be vortexed and mixed well.

iv).

Amplification is performed with the master cycler Realplex 2.0 (Eppendorf). The cycling consists of initial denaturation at 95°C for 3 minutes, followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 15 seconds and annealing/extension at 60°C for 1 minute.  After each cycle, the levels of fluorescence are measured. After each cycle, the levels of fluorescence are measured.

v)

At the end of the reaction, real time fluorescence measurements will be taken with a built in chargecoupled device (CCD) camera. A threshold will be set to be above the baseline that begins to detect the increase in signal associated with an exponential increase in PCR product. Samples will be defined as negative if there is no Ct (threshold cycle) value is after 40 cycles.

vi)

It is necessary to include a ‘no template control’ in each reaction run. This is to rule out the presence of fluorescence contaminants in the reaction mixture or in the heat block of the thermal cycler. A positive control should also be included, and this can be an in-vitro transcribed RNA plasmid DNA containing the target sequence, purified bacteria, or RNA DNA extracted from NHPB-infected hepatopancreas.

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Anexo 17 (cont.)

4.3.1.2.3.4. Sequencing RT-PCR products may be cloned and sequenced or sequenced directly when necessary to confirm infection by NHPB or to identify false positives or nonspecific amplification (Aranguren et al., 2010; Bustin et al., 2009; Vincent & Lotz, 2005). 4.3.1.2.4. Agent purification Methods for NHPB isolation and purification are available (Aranguren et al., 2010; Vincent & Lotz, 2005), but these are not recommended for routine diagnosis of NHP. 4.3.2

Serological methods

Not applicable because shrimp are invertebrate animals that do not produce specific antibodies that could be used to demonstrate infection by or prior exposure to NHPB.

5.

Rating of tests against purpose of use The methods currently available for targeted surveillance and diagnosis of NHPB are listed in Table 5.1. The designations used in the Table indicate: a = the method is the recommended method for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity; b = the method is a standard method with good diagnostic sensitivity and specificity; c = the method has application in some situations, but cost, accuracy, or other factors severely limits its application; and d = the method is presently not recommended for this purpose. These are somewhat subjective as suitability involves issues of reliability, sensitivity, specificity and utility. Although not all of the tests listed as category a or b have undergone formal standardisation and validation, their routine nature and the fact that they have been used widely without dubious results, makes them acceptable. Table 5.1. Methods for targeted surveillance and diagnosis Targeted surveillance Method

Presumptive diagnosis

Confirmatory diagnosis

Larvae

PLs

Juveniles

Adults

Gross signs

d

d

c

c

b

d

Bioassay

d

d

d

d

c

d

Direct LM

d

d

c

d

c

d

Histopathology

d

b

b

c

a

b

In-situ DNA probes

a

a

a

a

a

a

Transmission EM

d

d

d

d

c

c

Antibody-based assays

d

d

c

c

b

b

Real-time PCR

a

a

a

a

a

a

qPCR

a

a

a

a

a

a

PCR

a

a

a

a

a

a

Sequence

d

d

d

d

d

a

PLs = postlarvae; LM = light microscopy; EM = electron microscopy; PCR = polymerase chain reaction; qPCR = quantitative PCR.

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Anexo 17 (cont.)

6.

Test(s) recommended for targeted surveillance to declare freedom from Necrotising Hepatopancreatitis As indicated in Table 5.1, real-time PCR (Section 4.3.1.2.3.2) is the recommended method for targeted surveillance for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity. When investigating acute mortality episodes as part of a targeted surveillance programme, demonstration of pathognomonic NHPB-induced lesions in the hepatopancreas by histology (with or without confirmation by ISH with NHPB-specific DNA probes) is a suitable method (Table 5.1).

7.

Corroborative diagnostic criteria 7.1. Definition of suspect case A suspect case is represented by: •

Sudden high mortalities in late PL, juvenile or subadult P. vannamei or P. stylirostris in regions where NHPB is enzootic;



The sudden presence of numerous sea birds (gulls, cormorants, herons, terns, etc.) ‘fishing’ in one or more shrimp culture ponds;



Samples of cultured P. vannamei or P. stylirostris from ponds with feeding sea birds that present gross signs indicative of acute- or transition-phase NHP, such as a general atrophied hepatopancreas, reddish colouration, lethargy, soft shells, empty guts, and the presence of numerous irregular black spots on the cuticle;



Poor hatching success of eggs, and poor survival and culture performance of the larval and PL stages when broodstock are used from wild or farmed stocks where NHPB is enzootic.

7.2. Definition of confirmed case Any combination of a molecular (PCR or ISH) test and a morphological (histology) test using at least two of the following three methods (with positive results):

8.



Histological demonstration of diagnostic acute-phase NHPB lesions in (especially) the atrophied hepatopancreas with moderate atrophy of the tubule mucosa, presence of bacterial form and infiltrating haemocytes involving one or more of the tubules (multifocal encapsulations).



ISH positive histological signal to NHPB-type lesions.



PCR positive results for NHPB.

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96

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FOR

DISEASES

OF

CULTURED

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97 

Anexo 17 (cont.)

LIGHTNER D.V. (2005). BIOSECURITY IN SHRIMP FARMING: SURVEILLANCE. J. WORLD AQUACULT. SOC., 36, 229–248.

PATHOGEN EXCLUSION THROUGH USE OF

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SPF

STOCK AND ROUTINE

IN CULTURED PENAEID SHRIMP

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DETECCIÓN MEDIANTE ANÁLISIS EN FRESCO E 385, COL. PEDRO MARÍA ANAYA, MÉXICO, D.F.

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PCR

METHOD FOR THE DETECTION OF NECROTIZING

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HEPATOPANCREATITIS BACTERIUM

* * *

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Anexo 18

CHAPTER 2.2.5.

TAURA SYNDROME 1.

Scope Taura syndrome (TS) is a virus disease of penaeid shrimp caused by infection with Taura syndrome virus (TSV) (Bonami et al., 1997; Fauquet et al., 2005; Lightner 1996a; Mari et al., 1998).

2.

Disease information 2.1. Agent factors 2.1.1.

Aetiological agent, agent strains

The aetiological agent is TSV, as described by Bonami et al. (1997) and Mari et al. (1998; 2002). At least four genotypes (strains) have been documented based on the gene sequence encoding VP1 (= CP2), the largest and presumably dominant of the three major structural proteins of the virus. Based on VP1 (= CP2) sequence variations, these genotypic groups are: 1) the Americas group; 2) the South-East Asian group; 3) the Belize group; and 4) the Venezuelan group (Chang et al., 2004; Erickson et al., 2002; 2005; Nielsen et al., 2005; Tang & Lightner, 2005; Wertheim et al., 2009). At least two distinct antigenic variants of TSV have been identified by their differential reactivity to monoclonal antibody MAb 1A1, produced to a reference isolate from the Americas (TSV USA-HI94 – GenBank AF277675) (Mari et al., 2002; Poulos et al., 1999): Type A represents those that react to with MAb 1A1 (in the enzymelinked immunosorbent assay [ELISA], Western blots and in-situ hybridisation [ISH] immunohistochemistry (IHC) with infected tissues) and those that do not. The MAB 1A1 non-reactors were subdivided into Types B (TSV 98 Sinaloa, Mexico) and Type C (TSV 02 Belize), based on host species and virulence. All TSV isolates of the Americas and most, if not all, South-East Asian genotypes react with MAb 1A1. In marked contrast, none of the Belize genotype group reacts with MAb 1A1 (Erickson et al., 2002; 2005), nor does a TSV isolate from the 2005 epizootic in Venezuelan shrimp farms. TSV particles are 32 nm in diameter, non-enveloped icosahedrons and have a buoyant density of 1.338 g ml– The genome of TSV consists of a linear, positive-sense single-stranded RNA 10,205 nucleotides in length, excluding the 3’ poly-A tail, and it contains two large open reading frames (ORFs). ORF 1 contains the sequence motifs for nonstructural proteins, such as helicase, protease and RNA-dependent RNA polymerase. ORF 2 contains the sequences for TSV structural proteins, including the three major capsid proteins VP1, VP2 and VP3 (55, 40, and 24 kDa, respectively). The virus replicates in the cytoplasm of host cells (Bonami et al., 1997; Mari et al., 1998; 2002; Robles-Sikisaka et al., 2001). 1.

TSV has been assigned to the genus Aparavirus in the Family Dicistroviridae in the 9th report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV; King et al., 2012). Other reported causes of TS: Taura syndrome in Ecuador was initially linked to fungicide contamination of shrimp farms, a contention that was supported by litigation for ~ 16 years after the disease was scientifically shown to have a viral aetiology (Bonami et al., 1997; Hasson et al., 1995; Lightner, 2005). Hence, several papers in the literature propose a toxic aetiology for TS (Intriago et al., 1997; Jimenez, 1992; Jimenez et al., 2000). 2.1.2.

Survival outside the host

No information available. 2.1.3.

Stability of the agent (effective inactivation methods)

No information available.

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Anexo 18 (cont.)

2.1.4.

Life cycle

Not applicable. 2.2. Host factors 2.2.1.

Susceptible host species

The principal host species for TSV are the Pacific white shrimp, Penaeus vannamei, and the Pacific blue shrimp, P. stylirostris. While the principal host species for TSV all belong to the penaeid subgenus Litopenaeus, other penaeid species can be infected with TSV by direct challenge, although disease signs do not develop. Documented natural and experimental hosts for TSV include: P. setiferus, P. schmitti, P. monodon, P. chinensis, P. japonicus, P. aztecus, P. duorarum, P. indicus and Metapenaeus ensis (BondadReantaso et al., 2001; Brock, 1997; Brock et al., 1997; Chang et al., 2004; Lightner, 1996a, 1996b; Overstreet et al., 1997; Srisuvan et al., 2005; Stentiford et al., 2009; Wertheim et al., 2009). 2.2.2.

Susceptible stages of the host

TSV has been documented in all life stages (i.e. PL, juveniles and adults) of P. vannamei (the most economically significant of the two principal host species) except in eggs, zygotes and larvae (Lightner, 1996a). 2.2.3.

Species or subpopulation predilection (probability of detection)

No data. 2.2.4.

Target organs and infected tissue

TSV infects and has been shown to replicate (using ISH with specific DNA probes) principally in the cuticular epithelium (or hypodermis) of the general exoskeleton, foregut, hindgut, gills and appendages, and often in the connective tissues, the haematopoietic tissues, the lymphoid organ (LO), and antennal gland. The enteric organs (endoderm-derived hepatopancreas, midgut and midgut caeca mucosal epithelia) and smooth, cardiac, striated muscle, and the ventral nerve cord, its branches and its ganglia typically show no histological signs of infection by TSV and are usually negative for TSV by ISH (Bondad-Reantaso et al., 2001; Hasson et al., 1997; 1999a; 1999b; Jimenez et al., 2000; Lightner, 1996a; Lightner & Redman 1998a; 1998b; Lightner et al., 1995; Srisuvan et al., 2005). 2.2.5.

Persistent infection with lifelong carriers

Some members of populations of P. vannamei or P. stylirostris that survive TSV infections and/or epizootics may carry the virus for life (Hasson et al., 1999a; 1999b) and, although not documented, assumed to pass the virus to their progeny by vertical transmission. 2.2.6.

Vectors

Sea birds: TSV has been demonstrated to remain infectious for up to 48 hours (after ingestion of TSV-infected shrimp carcasses) in the faeces passed by wild or captive sea gulls (Larus atricilla) and chickens (Gallus domesticus, used as a laboratory surrogate for all shrimp-eating birds) thus suggesting that the virus can retain infectivity when passed through the gastro-intestinal system of any bird species. These findings implicate birds as being an important mechanical vector for the transmission of the virus within affected farms or farming regions (Garza et al., 1997; Vanpatten et al., 2004). Aquatic insects: the water boatman (Trichocorixa reticulata [Corixidae], an aquatic insect that feeds on shrimp carcasses in shrimp farm ponds), has also been shown to serve as a mechanical vector of TSV (Brock 1997; Lightner, 1995, 1996a, 1996b).

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Anexo 18 (cont.)

Frozen TSV-infected commodity products: TSV has been found in frozen commodity shrimp (P. vannamei) products in samples from markets in the USA that originated in Latin America and South-East Asia. Improper disposal of wastes (liquid and solid, i.e. peeled shells, heads, intestinal tracts, etc.) from value-added reprocessing of TSV-infected shrimp at coastal locations may provide a source of TSV that may contaminate wild or farmed stocks near the point of the waste stream discharge (Lightner, 1996b; Nunan et al., 2004). 2.2.7.

Known or suspected wild aquatic animal carriers

No data. 2.3. Disease pattern TS is best known as a disease of nursery- or grow-out-phase P. vannamei that occurs within ~14–40 days of stocking PLs into grow-out ponds or tanks, hence, shrimp with TS are typically small juveniles of from ~0.05 g to <5 g. Larger shrimp may also be affected, especially if they are not exposed to the virus until they are larger juveniles or adults (Brock, 1997; Brock et al., 1995; Lightner, 1996a, 1996b; Lotz, 1997). 2.3.1.

Transmission mechanisms

Transmission of TSV can be by horizontal or vertical routes. Horizontal transmission by cannibalism or by contaminated water has been demonstrated (Brock, 1997; Hasson et al., 1995; Lightner, 1996a, 1996b; White et al., 2002). Vertical transmission from infected adult broodstock to their offspring is strongly suspected but has not been experimentally confirmed. 2.3.2.

Prevalence

In regions where the virus is enzootic in farmed stocks, the prevalence of TSV has been found in various surveys to range from 0 to 100% (Brock, 1997; Jimenez et al., 2000; Laramore, 1997). 2.3.3.

Geographical distribution

TS is now widely distributed in the shrimp-farming regions of the Americas, South-East Asia and the Middle East (Bondad-Reantaso et al., 2001; Brock, 1997; Chang et al., 2004; Hasson et al., 1999a; Lightner, 1996a, 1996b; Lightner et al., 2012; Lotz et al., 2005; Nielsen et al., 2005; Tang & Lightner, 2005; Tu et al., 1999; Wertheim et al., 2009; Yu & Song, 2000). The Americas: following its recognition in 1992 as a distinct disease of cultured P. vannamei in Ecuador (Brock et al., 1995; Jimenez, 1992; Lightner et al., 1995), TS spread rapidly throughout many of the shrimpfarming regions of the Americas through shipments of infected PL and broodstock (Brock, 1997; Brock et al., 1997; Hasson et al., 1999a; Lightner, 1996a, 1996b; Lightner et al., 2012). Within the Americas, TS and/or TSV have been reported from virtually every penaeid shrimp-growing country in the Americas and Hawaii (Aguirre Guzman & Ascencio Valle, 2000; Brock, 1997; Lightner, 2011; Lightner et al., 2012; Robles-Sikisaka et al., 2001). TSV is enzootic in cultured penaeid shrimp stocks on the Pacific coast of the Americas from Peru to Mexico, and it has been occasionally found in some wild stocks of P. vannamei from the same region (Lightner & Redman, 1998a; Lightner et al., 1995). TSV has also been reported in farmed penaeid stocks from the Atlantic, Caribbean, and Gulf of Mexico coasts of the Americas, but it has not been reported in wild stocks from the these regions (Hasson et al., 1999a; Lightner, 1996a; 2005; 2011; Lightner et al., 2012). Asia and the Middle East: TSV was introduced into Chinese Taipei in 1999 with infected imported Pacific white shrimp, P. vannamei, from Central and South American sources (Tu et al., 1999; Yu & Song, 2000). Since that original introduction, the virus has spread with movements of broodstock and PL to China (People’s Rep. of), Thailand, Malaysia, and Indonesia where it has been the cause of major epizootics with high mortality rates in introduced unselected stocks of P. vannamei (Chang et al., 2004; Lightner, 2011; Nielsen et al., 2005; Tang & Lightner, 2005). Recently, TSV has also been associated with significant mortalities in P. indicus being farmed in Saudi Arabia (Wertheim et al., 2009).

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Anexo 18 (cont.)

2.3.4.

Mortality and morbidity

In on-farm epizootics of TS involving unselected (i.e. not selected for TSV resistance) stocks of P. vannamei, the principal host species for TSV, typical cumulative mortalities range from 40 to >90% in cultured populations of PL, juvenile, and subadult life stages. TSV-resistant lines of P. vannamei are available which show survival rates of up to 100% in laboratory challenge with all four TSV genotypes (Lightner et al., 2009; Moss et al., 2001). 2.3.5.

Environmental factors

Outbreaks of TS are more frequent when salinities are below 30 ppt (Jimenez et al., 2000). 2.4. Control and prevention 2.4.1.

Vaccination

No effective vaccines for TSV are available. 2.4.2.

Chemotherapy

No scientifically confirmed reports of effective chemotherapy treatments. 2.4.3.

Immunostimulation

No scientifically confirmed reports of effective immunostimulation treatments. 2.4.4.

Resistance breeding

After TS emerged in Ecuador in 1992–1994, P stylirostris were found that possessed resistance to TSV (genotype 1, MAb 1A1 Type A). Following from this discovery and due to TSV reaching Mexico in 1994 where it caused crop failures of P. vannamei, selected lines of TSV-resistant P. stylirostris became the dominant shrimp farmed in western Mexico from 1995. However, in 1998–1999, a new ‘strain’ of TSV (Type B; Erickson et al., 2002; Fegan & Clifford, 2001; Lightner, 1999; 2005; Zarin-Herzberg & Ascencio, 2001) emerged and caused massive epizootics in P. stylirostris. The emergence of this new ‘strain’ of TSV was soon followed in late 1999 by the introduction of white spot syndrome virus (WSSV) into shrimp farms in western Mexico, to which P. stylirostris had no resistance, effectively ending any interest in the culture of P. stylirostris in Mexico. TSV-resistant domesticated stocks of P. vannamei and P. stylirostris have been developed. Some domesticated lines of TSV-resistant P. vannamei (that are also TSV-free) are in widespread use by the shrimp-farming industries of the Americas and South-East Asia (Clifford, 1998; Moss et al., 2001; White et al., 2002). After the appearance of TS in Central America, improved TS resistance was reported in wild caught P. vannamei PLs used to stock shrimp farms in the region (Laramore, 1997). 2.4.5.

Restocking with resistant species

Selected lines of TS resistant P. vannamei have been developed and are commercially available (Clifford, 1998; Laramore, 1997; Moss et al., 2001; White et al., 2002). 2.4.6.

Blocking agents

Resistance to TSV infection was reported by expression of the TSV coat protein antisense RNA in P. vannamei zygotes. Transgenic juveniles reared from zygotes protected in this manner showed improved resistance to TSV challenge by per os or intramuscular (IM) injection routes (Lu & Sun, 2005). Similar results have been produced by injection of short random double-stranded RNAi sequences into juvenile P. vannamei (Robalino et al., 2004).

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Anexo 18 (cont.)

2.4.7.

Disinfection of eggs and larvae

While TSV is believed to be transmitted vertically (transovarian transmission), there have been no published report documenting this route of transmission. Disinfection of eggs and larvae (Chen et al., 1992) is good management practice and it is recommended for its potential to reduce TSV contamination of spawned eggs and larvae produced from them. 2.4.8.

General husbandry practices

Some husbandry practices have been applied successfully to reduce the risks TSV infections and disease occurring during farm grow-out. These include the application of polymerase chain reaction (PCR) prescreening of wild or pond-reared broodstock and/or their spawned eggs/nauplii and discarding those that test positive for the virus (Fegan & Clifford, 2001), fallowing and restocking of entire culture regions with TSVfree stocks (Dixon & Dorado, 1997), and the development of specific pathogen free (SPF) shrimp stocks of P. vannamei and P. stylirostris (Lightner, 1996b; 2005; Lotz et al., 1995; Moss et al., 2001; Pruder et al., 1995; Wyban 1992; Wyban et al., 2004). The adoption of the latter technology (SPF stocks) has proven to be among the most successful husbandry practice for the prevention and control of TS. Unfortunately, there is a misconception in the industry that SPF is a genetic trait rather than a condition of health status. The development of SPF P. vannamei that were free not only of TSV, but also of all the major known pathogens of penaeid shrimp, has resulted in the introduction of the species to Asia and to its surpassing P. monodon in 2005 as the dominant farmed shrimp species in Asia, as well as the Americas where the SPF stocks were developed (FAO, 2006; Lightner, 2005; Rosenberry, 2004).

3.

Sampling 3.1. Selection of individual specimens Suitable specimens for testing for infection by TSV include PL, juveniles and adults. While TSV may infect all life stages, infection severity, and hence virus load, may be below detection limits in spawned eggs and in the larval stages, so these life stages may not be suitable samples for TSV detection or certification of TS disease freedom. 3.2. Preservation of samples for submission For routine histology or molecular assays, and guidance on preservation of samples for the intended test method see Chapter 2.2.0. 3.3. Pooling of samples Samples taken for molecular tests may be combined as pooled samples representing no more than five specimens per pooled sample of juveniles, subadults and adults. However, for eggs, larvae and PL pooling of larger numbers (e.g. ~150 or more eggs or larvae or 50–150 PL depending on their size/age) may be necessary to obtain sufficient sample material (extracted nucleic acid) to run a diagnostic assay. See also Chapter 2.2.0. 3.4. Best organs and tissues TSV infects tissues of ectodermal and mesodermal origin. The principal target tissue in the acute phase of TS is the cuticular epithelium. In chronic infections the LO is the principal target tissue. Haemolymph or excised pleopods may be collected and used when non-lethal testing of valuable broodstock is necessary. 3.5. Samples/tissues that are not suitable TSV is a systemic virus, and it does not replicate in enteric tissues (e.g. the hepatopancreas, the midgut, or its caeca). Hence, enteric tissues are inappropriate samples for detection of infection by TSV.

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Anexo 18 (cont.)

4.

Diagnostic methods 4.1. Field diagnostic methods 4.1.1.

Clinical signs

Only acute-phase TS disease can be presumptively diagnosed from clinical signs. See Section 4.2 for a description of gross clinical signs presented by shrimp with acute-phase TS disease. 4.1.2.

Behavioural changes

Only shrimp with acute-phase TS disease present behavioural changes. Typically, severely affected shrimp apparently become hypoxic and move to the pond edges or pond surface where dissolved oxygen levels are higher. Such shrimp may attract seabirds in large numbers. In many TS disease outbreaks, it is the large numbers of seabirds attracted to the moribund shrimp that first indicate the presence of a serious disease outbreak (which is often either TS or WSD when sea birds are observed) to the farm manager. 4.2. Clinical methods 4.2.1.

Gross pathology

TS disease has three distinct phases, acute, transition, and chronic, which are grossly distinguishable (Hasson et al., 1999a; 1999b; Lightner, 1996a; 1996b; 2011; Lightner et al., 1995). Gross signs presented by juvenile, subadult and adult shrimp in the transition phase of TS are unique and provide a presumptive diagnosis of the disease. Acute phase: gross signs displayed by moribund P. vannamei with acute-phase TS include expansion of the red chromatophores giving the affected shrimp a general, overall pale reddish coloration and making the tail fan and pleopods distinctly red; hence ‘red tail’ disease was one of the names given by farmers when the disease first appeared in Ecuador (Lightner et al., 1995). In such shrimp, close inspection of the cuticular epithelium in thin appendages (such as the edges of the uropods or pleopods) with a ×10 hand lens reveals signs of focal epithelial necrosis. Shrimp showing these gross signs of acute TS typically have soft shells, an empty gut and are often in the late D stages of the moult cycle. Acutely affected shrimp usually die during ecdysis. If the affected shrimp are larger than ~1 g, moribund shrimp may be visible to sea birds at the pond edges and surface. Thus, during the peak of severe epizootics, hundreds of sea birds (gulls, terns, herons, cormorants, etc.) may be observed feeding on affected moribund shrimp that accumulate at the surface of the affected pond surface and edges (Brock, 1997; Brock et al., 1995; 1997; Garza et al., 1997; Lightner, 1996a; 1996b; 2011; Lightner et al., 1995; Vanpatten et al., 2004). Transition (recovery) phase: although only present for a few days during TS epizootics, the gross signs presented by shrimp in the transition phase can provide a tentative diagnosis of TSV infection. During the transition phase (which may be occurring while many shrimp in the affected populations are still in the acute phase and daily mortalities are high), fair to moderate numbers of shrimp in affected ponds show random, multifocal, irregularly shaped melanised cuticular lesions. These melanised spots are haemocyte accumulations indicating the sites resolving TS lesions in the cuticular epithelium. Such shrimp may or may not have soft cuticles and red-chromatophore expansion, and may be behaving and feeding normally (Brock, 1997; Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a; 2011). Chronic phase: after successfully moulting, shrimp in the transition phase move into the chronic phase of TS in which persistently infected shrimp show no obvious signs of disease (Brock, 1997; Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a; 1996b; 2011; Lightner et al., 1995). However, P. vannamei that are chronically infected with TSV may be less resistant to normal environmental stressors (i.e. sudden salinity reductions) than uninfected shrimp (Lotz et al., 1995). 4.2.2.

Clinical chemistry

Not applicable.

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Anexo 18 (cont.)

4.2.3.

Microscopic pathology (for penaeid hosts)

TS disease in the acute and chronic phases can be diagnosed most reliably using histological methods (Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a). Pathognomonic TSV-induced pathology is unique in acute-phase infections (Brock et al., 1995; Lightner, 1996a; 2011). In chronic TSV infections, the only lesion typically presented by infected shrimp is the presence of an enlarged LO with multiple LO spheroids (LOS) (Hasson et al., 1999b; Lightner 2011), which cannot be distinguished from LOS induced by chronic infections of other RNA viruses (Lightner, 1996a). When LOS are observed by routine histology and chronic TSV infection is suspected, a molecular test (ISH with TSV-specific probes, or reverse-transcription [RT] PCR [see Section 4.3.1.2.7]) is recommended for confirmation of TSV infection. 4.2.3.1. Acute phase of Taura syndrome Diagnosis of TS in the acute phase of the disease is dependent on the histological demonstration (in haematoxylin and eosin [H&E] stained preparations) of multifocal areas of necrosis in the cuticular epithelium of the general body surface, appendages, gills, hindgut, and foregut (the oesophagus, anterior and posterior chambers of the stomach). Cells of the subcuticular connective tissues and adjacent striated muscle fibres basal to affected cuticular epithelium are occasionally affected. In some severe cases of acute-phase TS, the antennal gland tubule epithelium is also destroyed. Prominent in the multifocal cuticular lesions are conspicuous foci of affected cells that display an increased eosinophilia of the cytoplasm and pyknotic or karyorrhectic nuclei. Cytoplasmic remnants of necrotic cells are often extremely abundant in these TS acutephase lesions and these are generally presented as spherical bodies (1–20 µm in diameter) that range in staining from eosinophilic to pale basophilic. These structures, along with pyknotic and karyorrhectic nuclei, give acute-phase TS lesions a characteristic ‘peppered’ or ‘buckshot-riddled’ appearance, which is considered to be pathognomonic for TS disease when there is no concurrent necrosis of the parenchymal cells of the LO tubules. The absence of necrosis of the LO in acute-phase TSV infections distinguishes TS disease from acute-phase yellowhead disease in which similar patterns of necrosis to those induced by TSV may occur in the cuticular epithelium and gills (Lightner, 1996a). In TSV-infected tissues, pyknotic or karyorrhectic nuclei give a positive (for DNA) Feulgen reaction, which distinguishes them from the less basophilic to eosinophilic cytoplasmic inclusions that do not contain DNA. The absence of haemocytic infiltration or other signs of a significant host-inflammatory response distinguishes the acute phase of TS from the transitional phase of the disease (Bondad-Reantaso et al., 2001; Brock, 1997; Brock et al., 1995; 1997; Erickson et al., 2002; 2005; Hasson et al., 1995; 1999a; 1999b; Lightner, 1996a; Lightner et al., 1995). 4.2.3.2. Transition (recovery) phase of Taura syndrome In the transitional phase of TS, typical acute-phase cuticular lesions decline in abundance and severity and are replaced by conspicuous infiltration and accumulation of haemocytes at the sites of necrosis. The masses of haemocytes may become melanised giving rise to the irregular black spots that characterise the transition phase of the disease. In H&E sections, such lesions may show erosion of the cuticle, surface colonisation and invasion of the affected cuticle and exposed surface haemocytes by Vibrio spp. (Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a; 2011). Sections of the LO during the transition phase of TS may appear normal with H&E staining. However, when sections of the LO are assayed for TSV by ISH with a specific cDNA probe (or by ISH with MAb 1A1 for TSV type A, genotype 1), large quantities of TSV are shown accumulating in the more peripheral parenchymal cells of the LO tubules (Hasson et al., 1999b; Srisuvan et al., 2005). 4.2.3.3. Chronic phase of Taura syndrome Shrimp in the chronic phase of TS display no gross signs of infection, and histologically the only sign of infection is the presence of numerous prominent LOS, which may remain associated with the main body of the paired LO, or which may detach and become ectopic LOS bodies that lodge in constricted areas of the haemocoel (i.e. the heart, gills, in the subcuticular connective tissues, etc.). Such LOS are spherical accumulations of LO cells and haemocytes and may be distinguished from normal LO tissues by their spherical nature and the lack of the central vessel that is typical of normal LO tubules. When assayed by ISH with a cDNA probe for TSV (or with MAb 1A1 using ISH) some cells in the LOS give positive reactions to the virus, while no other target tissues react (Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a; 1996b; 2011).

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Anexo 18 (cont.)

4.2.4.

Wet mounts

Direct microscopy of simple unstained wet mounts from excised pieces of the gills, appendage tips, etc., examined by phase- or reduced-light microscopy may be used to demonstrate (and make a tentative diagnosis of acute-phase TS) focal lesions of acute-phase TS in cuticular epithelial cells. Preparations presenting TS acute-phase lesions will contain numerous spherical structures (see the histopathological methods in Section 4.2.3 above), which are pyknotic and karyorrhectic nuclei and cytoplasmic remnants of necrotic cells. 4.2.5.

Smears

Not applicable. 4.2.6.

Fixed sections

See Section 4.2.3. 4.2.7.

Electron microscopy/cytopathology

Not currently applicable for diagnostic purposes. 4.3. Agent detection and identification methods 4.3.1.

Direct detection methods

4.3.1.1. Microscopic methods 4.3.1.1.1. Wet mounts See Section 4.2.4. 4.3.1.1.2. Smears See Section 4.2.5. 4.3.1.1.3. Fixed sections See Section 4.2.3. 4.3.1.2. Agent isolation and identification 4.3.1.2.1. Cell culture/artificial media TSV has not been grown in vitro, as no crustacean cell lines exist (Lightner, 1996a; Pantoja et al., 2004). Despite a publication that incorrectly reported that TSV infected human and monkey cell lines (Audelo del Valle et al., 2003), two other laboratories repeated the study and both found that TSV does not infect or replicate in primate or human cell lines with known susceptibility to human picornaviruses (Luo et al., 2004; Pantoja et al., 2004). 4.3.1.2.2. Antibody-based antigen detection methods An MAb for detection of TSV may be used to assay samples of haemolymph, tissue homogenates, or Davidson’s AFA-fixed tissue sections from shrimp (Erickson et al., 2002; 2005; Poulos et al., 1999). TSV MAb 1A1 may be used to distinguish some variants or ‘strains’ of TSV from other strains (Erickson et al., 2002; 2005).

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Anexo 18 (cont.)

4.3.1.2.3. Bioassay method Confirmation of TSV infection may be accomplished by bioassay of TSV-suspect animals with SPF juvenile P. vannamei serving as the indicator of the virus (Brock et al., 1997; Garza et al., 1997; Hasson et al., 1999b; 1995; Lightner, 1996a; Lotz, 1997; Overstreet et al., 1997). Oral or injection protocols may be used. The oral method is relatively simple to perform and is accomplished by feeding chopped carcasses of suspect shrimp to SPF juvenile P. vannamei in small tanks (White et al., 2002). The use of a negative control tank of indicator shrimp, which receive only SPF (TSV-free) tissue and normal shrimp feed is required. When the carcass feeding (per os) protocol is used to bioassay for TSV, TS-positive indicator shrimp (by gross signs and histopathology) are typically apparent within 3–4 days of initial exposure, and significant mortalities occur by 3–8 days after initial exposure. The negative control shrimp must remain negative (for at least 10–15 days) for gross or histological signs of TS disease and unusual mortalities (Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a; White et al., 2002). With the injection bioassay protocol, a variety of sample types may be tested for TSV. Whole shrimp are used if they were collected during a TSV epizootic. Heads only should be used if shrimp display gross transitionphase lesions (multifocal melanised spots on the cuticle) or no clinical signs of infection (chronic phase) as the virus, if present, will be concentrated in the LO (Hasson et al., 1999b; Lightner, 1996a). For non-lethal testing of broodstock, haemolymph samples may be taken and used to expose the indicator shrimp by IM injection (Lightner, 1996a). To perform the IM (injection) bioassay for TSV: Note that tissues and the resulting homogenate should be kept cool during the entire protocol by maintaining on ice. i)

Prepare a 1:2 or 1:3 ratio of TSV-suspect shrimp heads or whole shrimp with TN buffer (see Chapter 2.2.2, infectious hypodermal and haematopoietic necrosis [IHHN], for the composition of this buffer) or sterile 2% saline prepared with distilled water.

ii)

Homogenise the mixture using a tissue grinder or blender. Do not permit the mixture to heat up by excessive homogenisation or grinding.

iii)

Clarify the homogenate by centrifugation at 3000 g for 10 minutes. Decant and save the supernatant fluid. Discard the pellet.

iv)

Centrifuge the supernatant fluid at 27,000 g for 20–30 minutes at 4°C. Decant and save the supernatant fluid. Discard the pellet.

v)

Dilute the supernatant fluid from step iv to 1/10 to 1/100 with sterile 2% saline. This solution may now be used as the inoculum to inject indicator shrimp (or filter sterilised as described in step vi).

vi)

Filter the diluted supernatant fluid from step v using a sterile syringe (size depends on the final volume of diluted supernatant) and a sterile 0.45 µm syringe filter. Multiple filters may have to be used as they clog easily. Filtrate should be collected in a sterile test tube or beaker. The solution can now be stored frozen (recommend –20°C for short-term [weeks] storage and –80°C for long-term [months to years] storage) or used immediately to inject indicator shrimp.

vii)

Indicator shrimp should be from TSV-susceptible stocks of SPF P. vannamei (such as the ‘Kona stock’) (Moss et al., 2001), which are commercially available from a number of sources in the Americas, and not from selected lines of known TSV-resistant stocks.

viii) Inject 0.01 ml per gram of body weight using a 1 ml tuberculin syringe. Indicator shrimp should be injected intramuscularly into the third tail segment. If the test shrimp begin to die within minutes postinjection, the inoculum contains excessive amounts of proteinaceous material and should be further diluted prior to injecting additional indicator shrimp. Sudden death occurring post-injection is referred to as ‘protein shock’, and is the result of systemic clotting of the shrimp’s haemolymph in response to the inoculum (Lightner, 1996a; White et al., 2002). ix)

Haemolymph samples may be diluted (1/10 or 1/20 in TN buffer), filter sterilised (if necessary), and injected into the indicator shrimp without further preparation.

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Anexo 18 (cont.) x)

If TSV was present in the inoculum, the indicator shrimp should begin to die within 24–48 hours postinjection. Lower doses of virus may take longer to establish a lethal infection and shrimp should be monitored for at least 10–15 days post-injection.

xi)

The presence (or absence) of TSV in the indicator shrimp should be confirmed by histological analysis (and/or ISH by gene probe, if available) of Davidson’s fixed moribund shrimp. If additional confirmation is needed beyond demonstration of pathognomonic TSV lesions, RT-PCR with sequencing of the resulting amplicon can be carried out.

4.3.1.2.4. Sentinel shrimp bioassay method As a variation to the bioassay technique, a ‘sentinel shrimp’ system may be used. For example, TSV-sensitive stocks of small juvenile SPF P. vannamei may be held in net-pens in tanks, or in the same water system, with other shrimp of unknown TSV status to bioassay for the presence of infectious agents such as TSV. 4.3.1.2.5. Dot-blot immunoassay method i)

For the dot-blot immunoassay method, 1 µl of test antigen (purified virus, infected shrimp haemolymph or SPF shrimp haemolymph) is dotted on to the surface of MA-HA-N45 assay plates (Millipore, South San 3 Francisco, California [CA], USA) .

ii)

After air drying, the wells are blocked for 1 hour at room temperature with 200 µl of a buffer containing phosphate-buffered saline and 0.05% Tween 20 (PBST) mixed with 10% normal goat serum (Life Technologies, Gibco BRL) and 2% Hammersten casein (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, Illinois, USA).

iii)

The wells are washed three times with PBST and then reacted with 100 µl primary antibody (MAb or mouse polyclonal antibodies) for 30 minutes at room temperature.

iv)

Alkaline-phosphatase-labelled goat anti-mouse IgG,  chain specific, secondary antibody (Zymed, South San Francisco, CA) diluted 1/1000 in PBST plus 10% normal goat serum is used for detection (30 minutes at room temperature).

v)

After washing three times with PBST, once with PBS and once with distilled water, the reactions are visualised by development for 15 minutes at room temperature with nitroblue tetrazolium and bromochloro-indoyl phosphate (Roche Diagnostics, Corp.) in Tris-NaCl (100 mM each) buffer containing 50 mM MgCl2, pH 9.5.

vi)

Reactions are stopped with distilled water.

vii)

The reactions are graded using a scale from 0 to +4, with the highest intensity reaction being equivalent to the reaction generated using the MAb against the reference control consisting of semi-purified TSV. A negative reaction is one in which no coloured spot is visible in the well.

4.3.1.2.6. Other antibody-based methods The TSV MAb 1A1 may be applicable to other antibody-based test formats (i.e. indirect fluorescent antibody [IFAT] or immunohistochemistry [IHC] tests with tissue smears, frozen sections, or deparaffinised fixed tissues). MAb 1A1 is applicable for use in an IHC format using Davidson’s AFA-fixed tissue sections (Erickson et al., 2002; 2005). It is recommended that unexpected results from MAb-based tests for TSV should be interpreted in the context of clinical signs, case history, and in conjunction with other test results (e.g. RT-PCR test results, or findings from histology or ISH with a TSV-specific DNA probe – see appropriate sections in this chapter).

                                                             3

Reference to specific commercial products as examples does not imply their endorsement by the OIE. This applies to all commercial products referred to in this Aquatic Manual.

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Anexo 18 (cont.)

4.3.1.2.7. Molecular techniques ISH and RT-PCR tests for TSV have been developed, and kits of RT-PCR methods for TSV are commercially available. The dot-blot method for TSV detection is not available. 4.3.1.2.7.1. DNA probes for ISH applications with non-radioactive cDNA probes Non-radioactive, DIG-labelled cDNA probes for TSV may be produced in the laboratory. The ISH method provides greater diagnostic sensitivity than do more traditional methods for TSV detection and diagnosis that employ classic histological methods (Hasson et al., 1999a; Lightner, 1996a; 1999; Lightner & Redman 1998b; Mari et al., 1998). The ISH assay of routine histological sections of acute- and transition-phase lesions in the cuticular epithelium, other tissues, and of LOS in transition and chronic phase with a specific DIG-labelled cDNA probe to TSV, provides a definitive diagnosis of TSV infection (Hasson et al., 1999a; 1999b; Lightner, 1996a; 1996b). Pathognomonic TSV-positive lesions display prominent blue to blue-black areas in the cytoplasm of affected cells when reacted with the cDNA probes. Not reacting to the probe are the prominent karyorrhectic nuclear fragments and pyknotic nuclei that contribute to the pathognomonic ‘buckshot riddled’ appearance of TS lesions (Lightner, 1996a; Mari et al., 1998). (See Chapter 2.2.2 IHHN for details of the ISH method, and Chapter 2.2.0 Section B.5.3.ii for detailed information on the use of Davidson’s AFA fixative.) False-negative ISH results may occur with Davidson’s fixed tissues if tissues are left in fixative for more than 24–48 hours. The low pH of Davidson’s fixative causes acid hydrolysis of the TSV single-stranded RNA genome, resulting in false-negative probe results. This hydrolysis can be avoided through the use of neutral fixatives, including an ‘RNA-friendly’ fixative developed for shrimp, or by the proper use (avoiding fixation times over 24 hours) of Davidson’s fixative (Hasson et al., 1997; Lightner, 1996a; Lightner & Redman 1998). 4.3.1.2.7.2. Reverse-transcription (RT)-PCR method Tissue samples (haemolymph, pleopods, whole small shrimp, etc.) may be assayed for TSV using RT-PCR. Primers designated as 9992F and 9195R, amplify a 231 base pair (bp) sequence of the TSV genome (Nunan et al., 1998). The fragment amplified is from a conserved sequence located in the intergenic region and ORF 2 of TSV. Primer 9992F is located near the 3’ end of intergenic region and 9195R is located on ORF 2 within VP2 (= CP1) (Mari et al., 2002; Nunan et al., 1998). Recently, a new pair of TSV primers (7171F and 7511R) has been developed and shown to have an improved sensitivity for TSV detection (Navarro et al., 2009). Primer

Product

Sequence

G+C%

9992F

231 bp

5’-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3’

55%

5’-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3’

50%

5’-CGA-CAG-TTG-GAC-ATC-TAG-TG-3’

50%

5’-GAG-CTT-CAG-ACT-GCA-ACT-TC-3’

50%

9195R 7171F 7511R

341 bp

The RT-PCR method outlined below for TSV generally follows the method used in Nunan et al. (1998). i)

Preparation of RNA template: RNA can be extracted from fresh, frozen and ethanol-preserved tissues. Extraction of RNA should be performed using commercially available RNA tissue extraction kits, such as the High Pure RNA Tissue Kit (Roche, Penzberg, Germany) and following the manufacturer’s procedures for production of quality RNA templates.

ii)

The RT-PCR assay is carried out in solution, using 10 µl of total RNA extracted from haemolymph, frozen shrimp tissues, ethanol fixed tissue as the template (concentration of RNA = 1–100 ng ml–1).

iii)

The following controls should be included in every RT-PCR assay for TSV: a) known TSV-negative tissue sample; b) a known TSV-positive sample (tissue or purified virus); and c) a ‘no-template’ control.

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Anexo 18 (cont.)

iv)

The GeneAmp® EZ rTth RNA PCR kit (Applied Bioscience, Forster City, CA) is used for all amplification reactions described here.

v)

The optimised RT-PCR conditions (final concentrations in 50 µl total volume) for detection of TSV in shrimp tissue samples are: primers (0.46 0.62 µM each), dNTPs (300 µM each), rTth DNA polymerase (2.5 U 50 µl–1), manganese acetate (2.5 mM), in 5 × EZ buffer (25 mM Bicine, 57.5 mM potassium acetate, 40% [w/v] glycerol, pH 8.2).

vi)

If the thermal cycler does not have a heated lid, then light mineral oil (50 µl) is overlaid on the top of the 50 µl reaction mixtures to prevent condensation or evaporation during thermal cycling.

vii)

The RNA template and all the reagents are combined and reverse transcription is allowed to proceed at 60°C for 30 minutes, followed by 94°C for 2 minutes. Note: The reaction conditions described here were optimised using an automatic Thermal Cycler GeneAmp 980 (Applied Biosystems). The conditions should be optimised for each thermal cycler using known positive controls.

viii) At the completion of reverse transcription, the samples are amplified for 40 cycles under the following conditions: denaturation at 94°C for 45 seconds, and then annealing/extension at 60°C for 45 seconds. A final extension step for 7 minutes at 60°C follows the last cycle and the process is terminated in a 4°C soak file. ix)

Following the termination of RT-PCR, the amplified cDNA solutions are drawn off from beneath the mineral oil and placed into clean 0.5 ml microfuge tubes.

x)

A 10 µl sample of the amplified product can then be added to the well of a 2.0% agarose gel, stained with ethidium bromide (0.5 g ml–1), and electrophoresed in 0.5 × TBE (Tris, boric acid, ethylene diamine tetra-acetic acid [EDTA]).

xi)

A 1 kb DNA ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) is used as a marker.

xiii) Details of the composition of the reagents and buffers used here may be found in Chapter 2.2.2 IHHN. 4.3.1.2.7.3. Real-time PCR (qPCR) method for TSV Quantitative RT-PCR methods have been developed for the detection of TSV. These methods have the advantages of speed, specificity and sensitivity. The sensitivity of qRT-PCR is ~100 copies of the target sequence from the TSV genome (Dahr et al., 2002; Tang et al., 2004). The real-time RT-PCR method using TaqMan chemistry described below for TSV generally follows the method used in Tang et al. (2004). i)

The PCR primers and TaqMan probe were selected from the ORF1 region of the TSV genomic sequence (GenBank AFAF277675) that encodes for nonstructural proteins. The primers and TaqMan probe were designed by the Primer Express software (Applied Biosystems). The upstream (TSV1004F) and downstream (TSV1075R) primer sequences are: 5’-TTG-GGC-ACC-AAA-CGA-CAT-T-3’ and 5’GGG-AGC-TTA-AAC-TGG-ACA-CAC-TGT-3’), respectively. The TaqMan probe, TSV-P1 (5’-CAG-CACTGA-CGC-ACA-ATA-TTC-GAG-CAT-C-3’), which corresponds to the region from nucleotide 1024 to 1051, is synthesised and labelled with fluorescent dyes 5-carboxyfluoroscein (FAM) on the 5’ end and N,N,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) on the 3’ end (Applied Biosystems, catalog no. 450025).

ii)

Preparation of RNA template: the extraction and purification of RNA template from haemolymph, or shrimp tissue, is the same as that described in the section for traditional RT-PCR.

iii)

It is necessary to include a ‘no template control’ in each reaction run. This is to rule out the presence of fluorescence contaminants in the reaction mixture or in the heat block of the thermal cycler. A positive control should also be included, and this can be an in-vitro transcribed RNA containing the target sequence, purified virions, or RNA extracted from TSV-infected tissue.

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Anexo 18 (cont.)

iv)

The RT-PCR reaction mixture contains: TaqMan One-step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems, part no. 4309169), 0.3 µM of each primer, 0.1 µM of TaqMan probe, 5–50 ng of RNA, and water in a reaction volume of 25 µl. For optimal results, the reaction mixture should be vortexed and mixed well.

v)

Amplification is performed with the GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied osystems; ABI PRISM 7000, 7300, 7500, or newer models and brands can also be used). The cycling consists of reverse transcription at 48C for 30 minutes and initial denaturation at 95C for 10 minutes, followed by 40 cycles of denaturation at 95C for 15 seconds and annealing/extension at 60C for 1 minute. The levels of fluorescence are measured at the end of each annealing/extension cycle.

vi)

At the end of the reaction, real-time fluorescence measurements are analysed will be taken with a built in charge-coupled device (CCD) camera. A threshold will be set to be above the baseline that begins to detect the increase in signal associated with an exponential increase in PCR product. Samples will be defined as negative if there is no Ct (threshold cycle) value is after 40 cycles the Ct (threshold cycle) value is 40 cycles. Samples with a Ct value lower than 40 cycles are considered to be positive. To confirm the real-time RT-PCR results, an aliquot of RT-PCR product can be subjected to electrophoresis on a 4% ethidium bromide-agarose gel and exposed to UV light. A 72-bp DNA fragment can be visualised in the samples that are positive for TSV.

vi)

It is necessary to include a ‘no template control’ in each reaction run. This is to rule out the presence of fluorescence contaminants in the reaction mixture or in the heat block of the thermal cycler. A positive control should also be included, and this can be an in-vitro transcribed RNA containing the target sequence, purified virions, or RNA extracted from TSV-infected tissue.

4.3.1.2.7.4. Sequencing RT-PCR products may be cloned and sequenced when necessary to confirm infection by TSV or to identify false positives or nonspecific amplification (Mari et al., 2002; Nielsen et al., 2005; Srisuvan et al., 2005; Tang & Lightner, 2005; Wertheim et al., 2009).

4.3.1.2.8. Agent purification Methods for TSV isolation and purification are available (Bonami et al., 1997; Hasson et al., 1995; Mari et al., 2002; Poulos et al., 1999), but these are not recommended for routine diagnosis of TS.

4.3.2.

Serological methods

Not applicable because shrimp are invertebrate animals which do not produce specific antibodies that could be used to demonstrate infection by or prior exposure to TSV.

5.

Rating of tests against purpose of use The methods currently available for surveillance, detection, and diagnosis of TSV are listed in Table 5.1. The designations used in the Table indicate: a = the method is the recommended method for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity; b = the method is a standard method with good diagnostic sensitivity and specificity; c = the method has application in some situations, but cost, accuracy, or other factors severely limits its application; and d = the method is presently not recommended and/or not available for this purpose. These are somewhat subjective as suitability involves issues of reliability, sensitivity, specificity and utility. Although not all of the tests listed as category a or b have undergone formal standardisation and validation, their routine nature and the fact that they have been used widely without dubious results, makes them acceptable.

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Anexo 18 (cont.)

Table 5.1. TSV surveillance, detection and diagnostic methods in penaeids Surveillance Method

Presumptive diagnosis

Confirmatory diagnosis

Larvae

PLs

Juveniles

Adults

Gross signs

d

d

c

c

b

c

Bioassay

d

d

d

d

c

b

Direct LM

d

d

c

d

c

d

Histopathology

d

b

b

c

a

a

Transmission EM

d

d

d

d

c

c

Antibody-based assays

d

d

c

c

b

b

DNA probes  in situ

d

c

b

b

a

a

RT-PCR, qRT-PCR

a

a

a

a

a

a

Sequence

d

d

d

d

d

a

PLs = postlarvae; LM = light microscopy; EM = electron microscopy; RT-PCR = reverse-transcriptase polymerase chain reaction.

6.

Test(s) recommended for targeted surveillance to declare freedom from Taura syndrome As indicated in Table 5.1, RT-PCR (Section 4.3.1.2.7.2) is the recommended method for targeted surveillance for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity. When investigating acute mortality episodes as part of a targeted surveillance programme, demonstration of pathognomonic TSV-induced lesions in the cuticular epithelium by histology (with or without confirmation by ISH with TSV-specific DNA probes) is a suitable method (Table 5.1).

7.

Corroborative diagnostic criteria 7.1. Definition of suspect case A suspect case is represented by: •

Sudden high mortalities in late PL, juvenile or subadult P. vannamei or P. stylirostris in regions where TSV is enzootic;



The sudden presence of numerous sea birds (gulls, cormorants, herons, terns, etc.) ‘fishing’ in one or more shrimp culture ponds;



Samples of cultured P. vannamei or P. stylirostris from ponds with feeding sea birds that present gross signs indicative of acute- or transition-phase TS, such as a general reddish colouration, lethargy, soft shells, empty guts, and the presence of numerous irregular black spots on the cuticle; or



Demonstration of foci of necrosis in the cuticular epithelium using low magnification (i.e. a ×10 hand lens or by direct microscopic examination of wet mounts) to examine the edges of appendages such as uropods or pleopods, or the gills.

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113 

Anexo 18 (cont.)

7.2. Definition of confirmed case Any combination of a molecular (PCR or ISH) test and a morphological (histology) test using at least two of the following three methods (with positive results):

8.



Histological demonstration of diagnostic acute-phase TSV lesions in (especially) the cuticular epithelia of the foregut (oesophagus, anterior, or posterior chambers of the stomach) and/or in the gills, appendages, or general cuticle. Such TSV lesions are pathognomonic for TSV only when they occur without accompanying severe acute necrosis (with nuclear pyknosis and karyorrhexis) of the parenchymal cells of the lymphoid organ tubules (which may occur in acute-phase yellowhead virus infections).



ISH-positive (with a TSV-specific cDNA probe) signal to TSV-type lesions in histological sections (i.e. cuticular acute-phase TS lesions) or to distinctive lymphoid organ spheroids (LOS) in the lymphoid organs of shrimp with chronic phase TS lesions.



RT-PCR positive results for TSV.



Sequencing of PCR product encompassing CP2 may be accomplished, as needed, to determine the TSV genotype (Tang & Lightner, 2005; Wertheim et al., 2009).

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OF

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VANNAMEI

(CRUSTACEA:

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116

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IMPROVED

TAURA

SYNDROME VIRUS

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(TSV) RT-PCR

VIRUS

(TSV)

IN

USING NEWLY

THAILAND

AND ITS

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SOME PENAEID

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INFECTION OF

PENAEUS

MONODON WITH

TAURA

SYNDROME

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OF

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BY REAL-TIME

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117 

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OF

TAURA

ZARAIN-HERZBERG M. & ASCENCIO F. (2001). TAURA AQUACULTURE, 193, 1–9.

SYNDROME IN PACIFIC WHITE SHRIMP

SYNDROME IN

MEXICO:

IN

PACIFIC WHITE SHRIMP.

PENAEUS

VANNAMEI CULTURED IN

FOLLOW-UP STUDY IN SHRIMP FARMS OF

* * *

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

SINALOA.

119 

Anexo 19

CHAPTER 2.2.8.

INFECTION WITH YELLOW HEAD VIRUS 1.

Scope For the purpose of this chapter, yellow head disease (YHD) is considered to be infection with yellow head virus (YHV).

2.

Disease information 2.1. Agent factors 2.1.1.

Aetiological agent, agent strains

Yellow head virus (genotype 1) is one of six known genotypes in the yellow head complex of viruses and is the only known agent of YHD. Gill-associated virus (GAV) is designated as genotype 2. GAV and four other known genotypes in the complex (genotypes 3–6) occur commonly in healthy Penaeus monodon in East Africa, Asia and Australia and are rarely or never associated with disease (Walker et al., 2001, Wijegoonawardane et al., 2008a). YHV and other genotypes in the yellow head complex are classified by the International Committee on Taxonomy of Viruses as a single species (Gill-associated virus) in the genus Okavirus, family Roniviridae, order Nidovirales (Cowley et al., 2012). There is evidence of genetic recombination between genotypes (Wijegoonawardane et al., 2009). YHV forms enveloped, rod-shaped particles (40–60 nm × 150–200 nm). Envelopes are studded with prominent peplomers projecting approximately 11 nm from the surface. Nucleocapsids appear as rods (diameter 20–30 nm) and possess a helical symmetry with a periodicity of 5–7 nm. Virions comprise three structural proteins (nucleoprotein p24 and envelope glycoproteins gp64 and gp116) and a ~26 kb positivesense single-stranded RNA genome. 2.1.2.

Survival outside the host

YHV remains viable in aerated seawater for up to 72 hours (Flegel et al., 1995b). 2.1.3.

Stability of the agent (effective inactivation methods)

YHV can be inactivated by heating at 60°C for 15 minutes (Flegel et al., 1995b). Little information is available on other inactivation methods but the virus appears to be susceptible to treatment with chlorine at 30 parts per million (0.03 mg ml–1) (Flegel et al., 1997). 2.1.4.

Life cycle

High multiplicity YHV infections in cell culture have not been reported. Infection at a multiplicity of infection of 0.001 in primary cultures of lymphoid organ cells has indicated that maximum viral titres are obtained 4 days post-infection (Assavalapsakul et al., 2003). Clinical signs of YHD occur in P. monodon within 7–10 days of exposure. YHV replicates in the cytoplasm of infected cells in which long filamentous pre-nucleocapsids are abundant and virions bud into cytoplasmic vesicles in densely packed paracrystalline arrays for egress at the cytoplasmic membrane (Chantanachookin et al., 1993). 2.2. Host factors 2.2.1.

Susceptible host species

YHD outbreaks have been reported only in the black tiger prawn (P. monodon) and the white Pacific shrimp (P. vannamei) (Chantanachookin et al., 1993; Senapin et al., 2010). However, natural infections have also been detected in the kuruma prawn (P. japonicus), white banana prawn (P. merguiensis), Pacific blue prawn (P. stylirostris), white prawn (P. setiferus), red endeavour prawn (Metapenaeus

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120

Anexo 19 (cont.)

ensis), mysid shrimp (Palaemon styliferus) and krill (Acetes sp.). Other species of penaeid and palemonid shrimp and prawns and krill that have been reported to be susceptible to experimental infection include: brown tiger prawn (P. esculentus), brown prawn (P. aztecus); pink prawn, hopper and brown-spotted prawn (P. duorarum), greentail prawn (Metapenaeus bennettae), Sunda river prawn (Macrobrachium sintangense), barred estuarine shrimp (Palaemon serrifer), the paste prawn (Ascetes sp.) and the daggerblade grass shrimp (Palaemonetes pugio) (Ma et al., 2009). There are variations in the susceptibility of different species to disease. Laboratory trials have shown that YHV can cause high mortality in P. monodon, P. vannamei, P. stylirostrus, P. aztecus, P. duorarum, M. sintangense, P. styliferus and P. serrifer (Lightner et al., 1998; Longyant et al., 2005; 2006; Ma et al., 2009). A survey of 16 crab species collected from the vicinity of shrimp farms in Thailand detected no evidence of either natural infection or experimental susceptibility (Longyant et al., 2006). A critical review of susceptibility of crustaceans to yellow head disease and implications of inclusion in European legislation has been conducted (Stentiford et al., 2009). GAV has been detected in P. monodon and P. esculentus (Walker et al., 2001). To date, infections by other genotypes in the YHV complex have been detected only in P. monodon (Wijegoonawardane et al., 2008a). 2.2.2.

Susceptible stages of the host

Penaeus monodon are susceptible to YHV infection beyond PL15 (Khongpradit et al., 1995). Experimental infections with GAV indicate that larger (~20 g) P. japonicus are less susceptible to disease than smaller (~6– 13 g) shrimp of the same species (Spann et al., 2000). 2.2.3.

Species or subpopulation predilection (probability of detection)

Viruses in yellow head complex genotypes 2–6 are only known to occur commonly (prevalence up to 100%) in healthy P. monodon, which appears to be the natural host (Walker et al., 2001; Wijegoonawardane et al., 2008a; 2009). In contrast, YHV (genotype 1) infections are usually detected only when disease is event and whilst they do not occur commonly in healthy P. monodon, infections have been detected in healthy wild populations of P. stylirostris (Castro-Longoria et al., 2008). During YHD outbreaks in aquaculture ponds, the YHV infection prevalence can be assumed to be high. Natural YHV infections have been detected in P. japonicus, P. merguiensis, P. setiferus, M. ensis, and P. styliferus (Cowley et al., 2002; Flegel et al., 1995a; 1995b), but there is little information available on the natural prevalence. 2.2.4.

Target organs and infected tissue

YHV targets tissues of ectodermal and mesodermal origin including lymphoid organ, haemocytes, haematopoietic tissue, gill lamellae and spongy connective tissue of the subcutis, gut, antennal gland, gonads, nerve tracts and ganglia (Chantanachookin et al., 1993; Lightner, 1996). 2.2.5.

Persistent infection with lifelong carriers

GAV persists as a chronic infection for at least 50 days in P. esculentus that survive experimental challenge (Spann et al., 2003). The high prevalence of subclinical or chronic infection often found in healthy P. monodon infected with GAV (genotype 2) and genotypes 3–6 from postlarval stages onwardssuggests that these infections can perrsist for life (Walker et al., 2001; Wijegoonawardane et al., 2008a). There is also evidence that YHV (genotype 1) can persist in survivors of experimental infection (Longyant et al., 2005; 2006). 2.2.6.

Vectors

There are no known vectors of YHV. 2.2.7.

Known or suspected wild aquatic animal carriers

Infection susceptibility and long-term persistence indicate the potential for a wide range of wild penaeid and palemonid shrimp to act as carriers.

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121 

Anexo 19 (cont.)

2.3. Disease pattern 2.3.1.

Transmission mechanisms

YHV infection can be transmitted horizontally by injection, ingestion of infected tissue, immersion in sea water containing tissue extracts filtered to be free of bacteria, or by co-habitation of naive shrimp with infected shrimp (Flegel et al., 1995b; Lightner, 1996). Infection of shrimp has also been established by injection of extracts of paste prawns (Acetes sp.) collected from infected ponds (Flegel et al., 1995a). For GAV, vertical transmission of infection to progeny has been shown to occur from both male and female parents, possibly by surface contamination or infection of tissue surrounding fertilised eggs (Cowley et al., 2002). The dynamics of how YHV infection spreads within aquaculture ponds have not been studied. However, the rapid accumulation of mortalities during disease outbreaks suggests that horizontal transmission occurs very effectively. 2.3.2.

Prevalence

The infection prevalence of yellow head complex viruses in healthy P. monodon (as detected by nested polymerase chain reaction [PCR]) can be high (50–100%) in farmed and wild populations in Australia, Asia and East Africa as well as in L. vannamei farmed in Mexico (Castro-Longoria et al., 2008; Cowley et al., 2004; Sanchez-Barajas et al., 2009; Walker et al., 2001; Wijegoonawardane et al., 2008a). The prevalence of individual genotypes varies according to the geographical origin of the shrimp. In contrast, except in situations of disease outbreaks in aquaculture ponds, the prevalence of YHV (genotype 1) is more commonly low (<1%) in healthy wild or farmed P. monodon (pers. Comm.). The use of detection methods less sensitive than nested PCR (e.g. histology, immunoblot, dot-blot, in-situ hybridisation), is likely in most cases to result in the real infection prevalence amongst populations of shrimp being underestimated. 2.3.3.

Geographical distribution

YHD has been reported in Chinese Taipei, Indonesia, Malaysia, the Philippines, Sri Lanka, Thailand and Vietnam (Walker et al., 2001). GAV and other genotypes in the yellow head complex have been detected in healthy P. monodon from Australia, Chinese Taipei, India, Indonesia, Malaysia, Mozambique, the Philippines, Thailand and Vietnam (Wijegoonawardane et al., 2008a). YHV has also been detected in P. vannamei cultured in Mexico (Castro-Longoria et al., 2008; Sanchez-Barajas et al., 2009). 2.3.4.

Mortality and morbidity

With P. monodon being farmed in ponds, disease caused by YHV (genotype 1) can cause up to 100% mortality within 3–5 days of the first appearance of clinical signs (Chantanachookin et al., 1993). GAV (genotype 2) has also been associated with morbidity and up to 80% mortality in ponds of P. monodon farmed in Australia. Whilst mortalities can easily be induced by experimental exposure of P. monodon to YHV or GAV, bioassays have identified YHV to be far more virulent (~106-fold by lethal dose [LD50] 50% end-point analysis) (Oanh et al., 2011). Genotypes 3, 4, 5 and 6 have not yet been associated with disease (Wijegoonawardane et al., 2008a). 2.3.5.

Environmental factors

Elevated virus infection levels accompanied by disease can be precipitated by physiological stress induced by sudden changes in pH or dissolved oxygen levels, or other environmental factors (Flegel et al., 1997). The much higher virulence of YHV compared to GAV and other genotypes appears to ensure that the infection threshold required to cause disease is reached far more easily. 2.4. Control and prevention 2.4.1.

Vaccination

No effective vaccination methods have been developed.

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122

Anexo 19 (cont.)

2.4.2.

Chemotherapy

No effective commercial anti-viral product is yet available. 2.4.3.

Immunostimulation

No scientifically confirmed reports. 2.4.4.

Resistance breeding

Not reported. 2.4.5.

Restocking with resistant species

All marine shrimp species farmed commercially appear to be susceptible to YHV. 2.4.6.

Blocking agents

Injection of shrimp with double-stranded (ds) RNA homologous to ORF1a/1b gene regions of YHV or GAV (thus targeting the genome length viral RNA) can inhibit viral replication and prevent mortalities following experimental challenge. The antiviral action of the dsRNA appears to involve the RNA interference (RNAi) pathway (Tirasophon et al., 2007). 2.4.7.

Disinfection of eggs and larvae

Not reported. 2.4.8.

General husbandry practices

Specific pathogen free (SPF) or PCR-negative seedstock and biosecure water and culture systems may be used to reduce the risk of disease.

3.

Sampling 3.1. Selection of individual specimens For diagnosis during a disease outbreak, moribund shrimp collected from pond edges are the preferred source of material for examination. Apparently normal shrimp should also be collected from the same ponds. For surveillance for evidence of infection in populations of apparently healthy shrimp, life stages from mysis onwards (mysis, postlarvae [PL], juveniles or adults) can provide tissue sources useful for testing. 3.2. Preservation of samples for submission Moribund shrimp (or tissue from moribund shrimp) should be snap-frozen on-site in a dry ice/alcohol slurry and preserved frozen in dry ice, liquid nitrogen or in a –80°C freezer. Freezing at or above –20°C is unsuitable. Tissue samples for PCR screening should be preserved in a minimum 3-fold excess of 90% analytical/reagent-grade (absolute) ethanol. The use of lower grade (laboratory or industrial grade) ethanol is not recommended. Commercial RNA preservatives (e.g. RNAlater) may also be used. Tissue samples for histology should be preserved in Davidson’s fixative. Formalin (10%) in seawater may be a useful alternative. Tissues for electron microscopy should be sampled from live shrimp. For guidance on sample preservation methods for the intended test methods, see Chapter 2.2.0.

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Anexo 19 (cont.)

3.3. Pooling of samples For detecting YHV infection in large populations of shrimp, pooling of tissue samples is acceptable for screening or surveillance of batches of mysis to PL from a hatchery tank or batches of juvenile shrimp in a pond. For PCR analysis, pool size should be determined by tissue mass that can be processed without compromise in a single test. The total numbers of shrimp sampled, either as a single pool or as multiple smaller pools, are selected based on the infection prevalence expected and the required confidence limits of detection. Typically in populations comprising more than a 100,000 shrimp, if the prevalence of infection exceeds 5%, a total of 60 individuals tested in appropriate pool sizes will be required to detect YHV at a 95% confidence limit. However, definitive detection may be compromised if the YHV loads in the infected shrimp are very low or if tests less sensitive than two-step PCR or real-time PCR are employed. See also Chapter 2.2.0. 3.4. Best organs or tissues In moribund shrimp suspected to be infected with YHV, lymphoid organ and gill are the most suitable sample tissues. For screening or surveillance of juvenile or adult shrimp that appear grossly normal, lymphoid organ is preferred but gills or haemolymph can be used for non-sacrificial sampling for mysis to PL stages. 3.5. Samples/tissues that are not suitable Not determined.

4.

Diagnostic methods 4.1. Field diagnostic methods 4.1.1.

Clinical signs

Shrimp from late PL stages onwards can be infected experimentally with YHV. In cultured shrimp, infection can result in mass mortality occurring, usually in early to late juvenile stages. Moribund shrimp may exhibit a bleached overall appearance and a yellowish discoloration of the cephalothorax caused by the underlying yellow hepatopancreas, which may be exceptionally soft when compared with the brown hepatopancreas of a healthy shrimp. In many cases, the total loss of a pond crop occurs within a few days of the first appearance of shrimp showing gross signs of YHD (Chantanachookin et al., 1993). Cessation of feeding, congregation of moribund shrimp at pond edges and a generally bleached appearance are always seen in YHD outbreaks. However, these disease features are not particularly distinctive for YHD, and in the absence of other more pathognomonic gross signs are not reliable even for preliminary diagnosis of YHD. Gross signs of GAV disease include swimming near the surface and at the pond edges, cessation of feeding, a reddening of body and appendages, and pink to yellow discoloration of the gills (Spann et al., 1997). However, these signs can occur commonly in response to various stressors and thus are not considered pathognomonic for GAV disease. Shrimp chronically infected with YHV or GAV display normal appearance and behaviour. 4.1.2.

Behavioural changes

Exceptionally high feeding activity followed by an abrupt cessation of feeding may occur within 2–4 days of the appearance of gross clinical signs of disease and mortality. Moribund shrimp may congregate at pond edges near the surface (Chantanachookin et al., 1993). 4.2. Clinical methods 4.2.1.

Gross pathology

See Section 4.1. 4.2.2.

Clinical chemistry

None described.

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Anexo 19 (cont.)

4.2.3.

Microscopic pathology

Fix the cephalothorax tissues of moribund shrimp suspected to be affected by YHD in Davidson’s fixative, prepare tissue sections and stain with Meyer’s haematoxylin and eosin (H&E) using standard histological procedures (Lightner, 1996). Examine tissues of ectodermal and mesodermal origin by light microscopy for the presence of moderate to large numbers of deeply basophilic, evenly stained, spherical, cytoplasmic inclusions approximately 2 µm in diameter or smaller(Chantanachookin et al., 1993). Tissues of the lymphoid organ, stomach subcuticulum and gills are particularly informative.

4.2.4.

Wet mounts

Fix whole shrimp or gill filaments overnight in Davidson’s fixative (Lightner, 1996). After fixation, wash some gill filaments thoroughly with tap water to remove the fixative and stain with H&E (Lightner, 1996). After staining and dehydration, when the tissue is in xylene, place a gill filament on a microscope slide in a drop of xylene and, using a fine pair of needles (a stereo microscope is helpful), break off several secondary filaments. Replace the main filament in xylene where it can be stored indefinitely in a sealed vial as a permanent reference. Being careful not to let the xylene dry, tease apart the secondary filaments and remove any large fragments or particles that would thicken the mount unnecessarily. Add a drop of mounting fluid and a cover-slip and use light pressure to flatten the mount as much as possible. This procedure may also be used with thin layers of subcuticular tissue. Examine under a light microscope using a ×40 objective lens. For samples from YHD-affected shrimp, moderate to large numbers of deeply basophilic, evenly stained, spherical, cytoplasmic inclusions (approximately 2 µm in diameter or smaller) will be observed (Flegel et al., 1997). Evidence of such pathology should be used to support results from haemolymph smears (see below) in making a presumptive diagnosis of YHD. As for the fixed tissues and gill filaments preserved in xylene, these whole-mount slides can be preserved as a permanent record. If rapid results are required, the fixation step can be shortened to only 2 hours by replacing the acetic acid component of Davidson’s fixative with a 50% dilution of concentrated HCl. For good fixation, this fixative should not be stored for more than a few days before use. After fixation, wash thoroughly to remove the fixative and check that the pH has returned to near neutral before staining. Do not fix for longer periods or above 25°C as this may result in excessive tissue damage that will make it difficult or impossible to identify specific pathology.

4.2.5.

Smears

For moribund shrimp affected by YHD, haemolymph smears are not useful because haemocytes are usually depleted in the advanced stages of disease. In cases of suspected YHD where moribund shrimp have been sampled from a pond, haemolymph should be collected from grossly normal shrimp from the same pond. Draw the haemolymph into a syringe containing two volumes of either 25% formalin or Davidson’s fixative modified by replacing the acetic acid component with either water or formalin. Mix thoroughly, ignore clots in the syringe, place a drop on a microscope slide, smear and then air-dry before staining with H&E or other standard blood smear stains. Dehydrate, add mounting fluid and a cover-slip. Examine under a light microscope using a ×40 objective lens. For YHD-affected shrimp, some smears will show moderate to high numbers of haemocytes with karyorrhectic or pyknotic nuclei. It is important that there is no evidence of concomitant bacterial infection in slides of haemocytes displaying such nuclei,, as bacterial infections may cause similar changes in haemocytes. When making a presumptive diagnosis of YHD, the results from haemolymph smears should be considered in conjunction with the results from rapid-stained whole mounts (see above) or stained tissue sections.

4.2.6.

Electron microscopy/cytopathology

For transmission electron microscopy (TEM), the most suitable tissues of shrimp suspected to be infected with YHV infection are lymphoid organ and gills. For screening or surveillance of grossly normal shrimp, the most suitable tissue is lymphoid organ.

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Anexo 19 (cont.)

Stun live shrimp by immersion in iced water until just immobilised or kill by injection of fixative. Quickly dissect and remove small portions of target tissue (no larger than a few mm in diameter) and fix in at least 10 volumes . of 6% glutaraldehyde held at 4°C and buffered with sodium cacodylate (Na[CH3]2AsO2 3H2O) solution (8.6 g Na cacodylate, 10 g NaCl, distilled water to make 100 ml, adjusted to pH 7 with 0.2 N HCl) or phosphate solution (0.6 g NaH2PO4.H2O, 1.5 g Na2HPO4, 1 g NaCl, 0.5 g sucrose, distilled water to make 100 ml, adjusted to pH 7 with 0.2 N HCl). Fix for at least 24 h prior to processing. For long-term storage in fixative at 4°C, reduce glutaraldehyde to 0.5–1.0%. Processing involves post-fixation with 1% osmium tetroxide, dehydration, embedding, sectioning and staining with uranyl acetate and lead citrate according to standard TEM reagents and methods (Lightner, 1996). In the cytoplasm of cells infected with YHV, both nucleocapsid precursors and complete enveloped virions are observed. Nucleocapsid precursors appear as long filaments approximately 15 nm in diameter that can vary markedly in length (80–450 nm) and that can sometimes be packed densely in paracrystalline arrays. Virions appear as rod-shaped, enveloped particles (40–60 nm × 150–200 nm) with rounded ends and prominent projections (8–11 nm) extending from the surface. In the cell cytoplasm, virions are commonly seen to be localised or packed densely within intracellular vesicles. Virions may also be seen budding at the cytoplasmic membrane and in interstitial spaces. GAV virions and nucleocapsids are indistinguishable from YHV by TEM. Lymphoid organ spheroids are commonly observed in healthy P. monodon chronically infected with YHV or GAV and lymphoid organ necrosis often accompanies disease (Spann et al., 1997). However, spheroid formation and structural degeneration of lymphoid organ tissue also result from infection by other shrimp viruses (Lightner, 1996). 4.3. Agent detection and identification methods 4.3.1.

Direct detection methods

4.3.1.1. Microscopic methods 4.3.1.1.1. Wet mounts See Section 4.2.4. 4.3.1.1.2. Smears See Section 4.2.5. 4.3.1.1.3. Fixed sections See Section 4.2.3. 4.3.1.2. Agent isolation and identification 4.3.1.2.1. Cell culture/artificial media Although primary shrimp cell culture methods are available, they are not recommended to isolate and identify YHV as a routine diagnostic method because of the high risk of them becoming contaminated with adventitious agents. No continuous cell lines suitable for YHV culture are yet available. 4.3.1.2.2. Antibody-based antigen detection methods Reagents and protocols for detecting YHV proteins with antibodies have been published (Loh et al. 1998; Lu et al. 1994). Virions purified from haemolymph of experimentally infected shrimp have been used to produce antiserum in New Zealand white rabbits. From this antiserum, immunoglobulin (IgG) was purified using protein-G-linked columns and cross-reacting normal shrimp antigens were removed by adsorption to acetonedried, ground shrimp muscle tissue and haemolymph. To detect YHV proteins by Western blotting, dilute 0.1 ml haemolymph collected from a live shrimp in an equal volume of citrate buffer and either run immediately or store at –80°C until used. Clarify 200 µl of the sample at 8000 g for 5 minutes and then pellet virions from the clarified supernatant by ultracentrifugation at 140,000 g for 5 minutes. Resuspend pellets in 100 µl 2 × loading buffer (2.5 ml 0.5 mM Tris/HCl pH 6.8, 4 ml 10% sodium dodecyl sulphate [SDS], 2 ml glycerol, 1 µl mercaptoethanol, 0.5 ml deionised distilled water) and heat at 95°C for 5 minutes. Load 10 µl sample onto a 5% SDS-polyacrylamide gel and electrophorese at 200 V. Blot the gel onto a 0.1 mm pore size nitrocellulose membrane in blotting buffer (3.03 g Tris-base, 14.4 g glycine, 200 ml methanol per litre) at 100 V for 1 hour. Rinse the membrane with phosphate buffered saline (PBS pH 7.4), block in 5% skim milk (in PBS) for 1 hour,

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Anexo 19 (cont.) and rinse with PBS for 5 minutes. Soak the membrane in a 1/1000 dilution of the anti-YHV antibody (IgG) for 1 hour, rinse three times with PBS for 5 minutes, and then soak for 1 hour in a 1/2500 dilution of goat anti-rabbit IgG-horseradish-peroxidase (HRP) conjugate. Rinse membrane three times with PBS for 5 minutes and then soak in HRP substrate 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine , until blue-purple colour develops. Stop the reaction by soaking the membrane in distilled water. All incubations should be carried out at 25°C ± 2°C. Use a purified viral preparation as a positive control to identify positions of the YHV 116 kDa, 64 kDa and 20 kDa structural proteins. The Western blot YHV detection sensitivity is approximately 0.4 ng YHV protein (≈ 106 virions). 4.3.1.2.3. Molecular techniques 4.3.1.2.3.1 Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) Three RT-PCR protocols are described. The first is a 1-step RT-PCR adapted from Wongteerasupaya et al. (1997) that can be used to detect YHV in shrimp affected by YHD. This protocol will detect YHV (highly virulent genotype first detected in Thailand in association with YHD) but not GAV or any of the other three genotypes currently recognised. The second is a more sensitive multiplex nested RT-PCR protocol adapted from Cowley et al. (2004). It can be used to differentiate YHV from GAV in diseased shrimp or for screening healthy carriers. This test will not detect all six known genotypes and genotype 3 may generate a PCR product indistinguishable in size from that generated with GAV (genotype 2). The test is available in a suitably modified form from a commercial source (YHV/GAV IQ2000, GeneReach Biotechnology Corp., Chinese Taipei). However, this kit is not currently listed as having completed the OIE’s formal process for validating and certifying commercial tests (a list of certified test kits and manufacturers is available on the OIE website: http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/registration-of-diagnostic-kits/background-information/). The third is a sensitive multiplex RT-nested PCR protocol described by Wijegoonawardane et al. (2008b). This test can be used for screening healthy shrimp for any of the six genotypes of the yellow head complex of viruses (including YHV and GAV), but will not discriminate between genotypes. Assignment of genotype can be achieved by nucleotide sequence analysis of the RT-PCR product.

Sample preparation: For juvenile or adult shrimp, lymphoid organ, gill tissue or haemolymph may be used to prepare total RNA. Fresh tissue is preferred. Lymphoid organ and gill tissue preserved in 95% analytical-grade ethanol or RNAlater (various manufacturers), or stored frozen at –70°C are also suitable for total RNA preparation. Disrupt 10–20 mg lymphoid organ or gill tissue or 50 µl haemolymph in 500 µl 4 TrizolTM reagent and extract total RNA according to the product manual. Resuspend RNA in 25 µl water treated with DEPC (diethyl-pyrocarbonate)-, heat at 55°C for 10 minutes, cool on ice and use immediately or store at –70°C until required. Ideally, a 1/200 dilution (i.e. 2.5 µl RNA in 500 µl DEPCtreated water) should be prepared, and UV absorbances at A260nm and A280 nm (a UV spectrophotometer is required) should be determined to quantify and check the quality of the RNA (ratio approximately 2:1). RNA yield will vary depending on the type and freshness of tissues, quality of the preservative used, and the length of time tissue has been preserved. However, RNA yields from fresh tissues would be expected to vary from 0.2 to 2.0 µg µl–1 and about half these amounts from alcoholpreserved tissues. From a nursery tank or hatchery tank containing 100,000 PL or more, sample approximately 1000 PL from each of 5 different points. Pool the samples in a basin, gently swirl the water and then select samples of live PL that collect at the centre of the basin. Choose numbers of PL to be pooled and tested according to the assumed or infection prevalence. Homogenise tissue samples in an appropriate volume of TrizolTM reagent and extract RNA according to the product manual. Based on the standard TrizolTM extraction procedure, tissue masses equivalent to 25–30 × PL5, 15 × PL10 and 5 × PL15 are accommodated and produce high quality total RNA free of protein contamination. For each set of RNA samples to be tested, DEPC-treated water and extracts known to contain YHV RNA and/or GAV RNA (as appropriate to the test) should be included as negative and positive controls, respectively.

                                                             4

Reference to specific commercial products as examples does not imply their endorsement by the OIE. This applies to all commercial products referred to in this Aquatic Manual.

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Anexo 19 (cont.)

Protocol 1: RT-PCR for specific detection of YHV in diseased shrimp To synthesise cDNA, mix 2 µl RNA in 20 µl PCR buffer (10 mM Tris/HCl pH 8.3, 50 mM KCl) containing 2.5 U of M-MLV (Moloney murine leukaemia virus) reverse transcriptase, 1.0 U ribonuclease inhibitor, 0.75 µM antisense primer 144R, 1 mM each of dATP, dTTP, dCTP, and dGTP, and 5 mM MgCl2, and incubate at 42°C for 15 minutes. Incubate the mixture at 100°C for 5 minutes to inactivate the reverse transcriptase and allow the mixture to cool to 5°C. Add PCR mixture (10 mM Tris/HCl pH 8.3, 50 mM KCl) containing 2.5 U Taq DNA polymerase, 2 mM MgCl2 and 0.75 µM of sense primer 10F to give a final volume of 100 µl. Unless the instrument is fitted with a heated lid, overlay the tubes with 100 µl of mineral oil and conduct PCR amplification for 40 cycles at 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds, and finishing at 72°C for 10 minutes. Alongside a suitable DNA ladder, apply a 20 µl aliquot of the PCR to a 2% agarose/TAE (Trisacetate-EDTA [ethylene diamine tetra-acetic acid]) gel containing 0.5 µg ml–1 ethidium bromide and following electrophoresis, detect the 135 bp DNA band expected for YHV using a UV transilluminator. The sensitivity of the PCR is approximately 0.01 pg of purified YHV RNA (≈ 103 genomes). PCR primer sequences: 10F:

5’-CCG-CTA-ATT-TCA-AAA-ACT-ACG-3’

144R: 5’-AAG-GTG-TTA-TGT-CGA-GGA-AGT-3’ Protocol 2: Nested RT-PCR for differential detection of YHV and GAV in healthy or diseased shrimp For cDNA synthesis, 2 µl RNA (ideally 1.0 µg total RNA, if quantified),0.7 µl 50 pmol µl–1 primer GY5 and DEPC-treated water are added to 6 µl total, the mixture , incubated at 70°C for 10 minutes and chilled on ice. Add 2 µl Superscript II buffer × 5 (250 mM Tris/HCl pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 1 µl 100 mM DTT and 0.5 µl 10 mM dNTP stock mixture (i.e. 10 mM dATP, 10 mM dTTP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP) and mix gently. Preheat to 42°C for 2 minutes, add 0.5 µl 200 U µl–1 reverse transcriptase and incubate at 42°C for 1 hour. Heat the reaction at 70°C for 10 minutes, chill on ice and spin briefly in a microcentrifuge to collect the contents of the tube. For the first PCR step, prepare a 50 µl reaction mixture containing 1 × Taq buffer (10 mM Tris/HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1.5 mM MgCl2, 35 pmol of each primer GY1 and GY4, 200 µM each of dATP, dTTP, dCTP and dGTP and 2.5 U Taq polymerase in a 0.5 ml thin-walled tube. Overlay the reaction mixture with 50 µl liquid paraffin, heat at 85°C for 2–3 minutes and then add 1 µl cDNA. Conduct PCR amplification using 35 cycles at 95°C for 30 seconds, 66°C for 30 seconds, and 72°C for 45 seconds, followed by final extension at 72°C for 7 minutes. For the second PCR step, prepare a 50 µl reaction mixture containing 2 µl of the first step PCR product, 1 × Taq buffer (above), 1.5 mM MgCl2, 35 pmol of each primer GY2, Y3 and G6, 200 µM each of dATP, dTTP, dCTP and dGTP and 2.5 U Taq polymerase in a 0.5 ml thin-walled tube and overlay with liquid paraffin. Conduct PCR using amplification conditions as described above. Apply a 10 µl aliquot of the PCR to 2% agarose/TAE gels containing 0.5 µg ml–1 ethidium bromide alongside a suitable DNA ladder and detect using a UV transilluminator. If the viral load is sufficiently high, a 794 bp DNA will be amplified from either GAV or YHV in the first PCR step. In the second PCR step, a 277 bp product indicates detection of YHV and a 406 bp product indicates detection of GAV. The presence of both 406 bp and 277 bp products indicates a dual infection with GAV and YHV. The detection sensitivity of the second-step PCR is ~1000-fold greater than the first-step PCR and GAV or YHV RNA can be detected to a limit of 10 fg lymphoid organ total RNA. The sequences of RT-PCR primers generic for GAV and YHV (GY) or specific for GAV (G) or YHV (Y) are as follows: GY1: 5’-GAC-ATC-ACT-CCA-GAC-AAC-ATC-TG-3’ GY2: 5’-CAT-CTG-TCC-AGA-AGG-CGT-CTA-TGA-3’ GY4: 5’-GTG-AAG-TCC-ATG-TGT-GTG-AGA-CG-3’

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Anexo 19 (cont.)

GY5: 5’-GAG-CTG-GAA-TTC-AGT-GAG-AGA-ACA-3’ Y3:

5’-ACG-CTC-TGT-GAC-AAG-CAT-GAA-GTT-3’

G6:

5’-GTA-GTA-GAG-ACG-AGT-GAC-ACC-TAT-3’

NB: Due to reported problems with primer specificity for some emerging strains, all PCR products generated using protocol 2 should be sequenced to confirm the virus genotype. Protocol 3: Nested RT-PCR for detection of all currently known genotypes in the yellow head complex (including YHV and GAV) For cDNA synthesis, mix 2 µl RNA (ideally 1.0 µg total RNA, if quantified), 50 ng random hexamer primers and 1.0 µl 10 mM dNTP and make up to a total volume of 14 µl in sterile DEPC-treated water, incubate at 65°C for 5 minutes and chill on ice. Add 4.0 µl Superscript III buffer × 5, 1.0 µl 100 mM DTT, 1.0 µl 40 U µl–1 RNaseOUTTM (Invitrogen) and 1.0 µl 200 U µl–1 reverse transcriptase and mix gently. Incubate at 25°C for 5 minutes and then at 42°C for 55 minutes, stop the reaction by heating at 70°C for 15 minutes, chill on ice and spin briefly in a microcentrifuge to collect the contents of the tube. For the first PCR step, add 1 µl cDNA to a total 25 µl reaction mixture containing 1 × Taq buffer (10 mM Tris/HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X100), 1.5 µl 25 mM MgCl2, 0.35 µl primer mix containing 25 pmol µl–1 of each primer pool (see below) YCF1ab and YC-R1ab, 0.5 µl 10 mM dNTP mix and 0.25 µl 5 U µl–1 Taq DNA polymerase. Conduct PCR amplification using denaturation at 95°C for 1 minute followed by 35 cycles at 95°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, 72°C for 40 seconds, followed by a final extension at 72°C for 7 minutes. For the second PCR step, use 1 µl of the first PCR product in the reaction mixture as prepared above but substituting primer pools YC-F2ab and YC-R2ab. Conduct PCR amplification using denaturation at 95°C for 1 minute followed by 35 cycles at 95°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds, followed by a final extension at 72°C for 7 minutes. Apply an 8 µl aliquot of the PCR to 2% agarose/TAE gels containing 0.5 µg ml–1 ethidium bromide alongside a suitable DNA ladder and detect using a UV transilluminator. If the viral load is sufficiently high, a 358 bp DNA is amplified in the first PCR step. The second (nested) PCR step amplifies a 146 bp product. The detection of these products indicates detection of one of the six genotypes in the yellow head complex. Further assignment of genotype (if required) is possible by nucleotide sequence analysis of either PCR product followed by comparison with sequences of the known genotypes by multiple sequence alignment and phylogenetic analysis. The detection sensitivity limits of the first PCR step and nested PCR step are 2,500 and 2.5 RNA templates, respectively. PCR primer sequences (each primer comprises a pool of equal quantities of two related oligonucleotide sequences): YC-F1ab pool: 5’-ATC-GTC-GTC-AGC-TAC-CGC-AAT-ACT-GC-3’ 5’-ATC-GTC-GTC-AGY-TAY-CGT-AAC-ACC-GC-3’ YC-R1ab pool: 5’-TCT-TCR-CGT-GTG-AAC-ACY-TTC-TTR-GC-3’ 5’-TCT-GCG-TGG-GTG-AAC-ACC-TTC-TTG-GC-3’ YC-F2ab pool: 5’-CGC-TTC-CAA-TGT-ATC-TGY-ATG-CAC-CA-3’ 5’-CGC-TTY-CAR-TGT-ATC-TGC-ATG-CAC-CA-3’ YC-R2ab pool: 5’-RTC-DGT-GTA-CAT-GTT-TGA-GAG-TTT-GTT-3’ 5’-GTC-AGT-GTA-CAT-ATT-GGA-GAG-TTT-RTT-3’ Mixed base codes: N(AGCT).

R(AG), Y(CT), M(AC), K(GT), S(GC), W(AT), H(ACT), B(GCT), V(AGC), D(AGT),

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Anexo 19 (cont.)

4.3.1.2.3. In-situ hybridisation The protocol of Tang et al. (2002) described is suitable for detecting YHV or GAV (Tang & Lightner, 1999). To preserve viral RNA accessibility, fix tissues sampled from live shrimp in neutral-buffered, modified Davidson’s fixative without acetic acid (RF-fixative) (Hasson et al., 1997). To achieve good tissue preservation whilst also preserving RNA accessibility, normal Davidson’s fixative can be used as long as the fixation time is limited to 24 hours (maximum of 48 hours). Process the fixed tissue using standard histological methods and prepare 4 µm thick sections on Superfrost Plus slides (Fisher Scientific, Pennsylvania, USA). Prior to hybridisation, incubate sections at 65°C for 45 minutes, remove paraffin with Hemo-De (Fisher Scientific, Pennsylvania, USA), and rehydrate through a reducing ethanol concentration series to water. Digest sections with proteinase K (100 µg ml–1, in 50 mM Tris/HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA) for 15 minutes at 37°C, followed by post-fixation in 0.4% formaldehyde for 5 minutes. Rinse in 2 × SSC (standard saline citrate), then prehybridise with 500 µl pre-hybridisation solution (4 × SSC, 50% formamide, 1 × Denhardt’s, 0.25 mg ml–1 yeast RNA, 0.5 mg m–1 sheared salmon sperm DNA, 5% dextran sulphate) at 42°C for 30 minutes. For hybridisation, overlay the sections with 250 µl hybridisation solution containing a digoxigenin-labelled DNA probe (20–40 ng ml–1) at 42°C overnight. The next day, wash the sections as follows: 2 × SSC once for 30 minutes at room temperature; 1 × SSC twice for 5 minutes at 37°C; 0.5 × SSC twice for 5 minutes at 37°C. Incubate the sections with sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase conjugate (Roche) at 37°C for 30 minutes. Wash with 0.1 M Tris/HCl pH 7.5, 0.15 M NaCl twice for 10 minutes at room temperature and rinse with 0.1 M Tris/HCl pH 9.5, 0.1 M NaCl. Incubate with nitroblue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3indoyl phosphate in the dark for 1–2 h for colour development. Counterstain with Bismarck Brown Y (0.5%), dehydrate through a series of ethanol and Hemo-De, add Permount (Fisher Scientific, Pennsylvania, USA) and cover with a cover-slip. YHV-infected cells give a blue to purple-black colour against the brown counter stain. Include positive controls of YHV-infected tissue and negative controls of uninfected shrimp tissue. The digoxigenin-labelled DNA probe can be prepared by PCR labelling using the following primers: YHV1051F:

5’-ACA-TCT-GTC-CAG-AAG-GCG-TC-3’

YHV1051R:

5’-GGG-GGT-GTA-GAG-GGA-GAG-AG-3’

4.3.1.2.3 Agent purification A YHV purification method based on density gradient ultracentrifugation is described (Wongteersupaya et al. 1995). Approximately 250 healthy juvenile P. monodon shrimp (approximately 10 g) should ideally be used as a source of virus for purification. After acclimatising for several days in 1500 litre tanks (approximately 80 shrimp/tank) at a salinity of 3.5 parts per thousand (mg ml–1), inoculate each shrimp intramuscularly with 100 µl of a 1/100 gill extract suspension prepared from YHV-infected shrimpAt 2 days post-infection, harvest moribund shrimp showing typical signs of YHD. Use a syringe ro draw haemolymph from the sinuses at the base of the walking legs and mix carefully on ice with the same volume of lobster haemolymph medium (LHM) (486 mM NaCl, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM Na2HPO4 8.1 mM MgSO4, 36 mM NaHCO3, 0.05% dextrose in Minimal Eagle’s Medium, adjusted pH 7.6 with 1 N NaOH). Centrifuge the mixture at 480 g for 30 minutes at 4°C to remove cellular debris. Untracentrifuge the supernatant at 100,000 g for 1 hour at 4°C. Discard the supernatant and gently resuspend the pellet overnight at 4°C in 1 ml LHM. Layer this suspension over a continuous gradient of 20–40% Urografin and ultracentrifuge at 100,000 g for 1 hour at 4°C. After centrifugation, collect the viral band by using a Pasteur pipette and dilute with NTE buffer (0.02 M EDTA, 0.2 M NaCl, 0.2 M Tris/HCl [pH 7.4]) to a final volume of 12 ml. Ultracentrifuge the suspension at 100,000 g for 1 hour at4C and resuspend the pellet (purified virus) in 100 µl TE buffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA [pH 7.4]) and store in 20 µl aliquots at –80C until required. 4.3.1.2.4 Bioassay The bioassay procedure is based on that described by Spann et al. (1997), but similar procedures have been described by several other authors (Lu et al., 1994). The bioassay should be conducted in susceptible shrimp (see Section 2.2 above) ideally that have been certified as SPF and have been obtained from a biosecure breeding facility. Alternatively, susceptible wild or farmed shrimp to be used for bioassay should be screened by nested RT-PCR using RNA extracted from haemolymph to confirm the absence of pre-existing chronic infections with YHV, GAV or related viruses. Throughout the procedure, shrimp should be maintained under optimal conditions for survival of the species in laboratory tank systems.

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Anexo 19 (cont.)

Collect moribund shrimp from a YHD-affected ponds or shrimp suspected of being carriers of infection and maintain at 4°C or on ice. Remove and discard the tail and appendages. If necessary, the whole shrimp or the retained cephalothorax may be snap-frozen and stored at –80°C or in liquid nitrogen until required. Thaw stored samples rapidly in a 37°C water bath within two snap-seal plastic bags and then maintain at 4°C or on ice during all procedures. Remove the carapace and calciferous mouth-parts. Suspend the remaining tissues in six volumes of TN buffer (0.02 M Tris/HCl, pH 7.4, 0.4 M NaCl) and homogenise in a tissue grinder to form a smooth suspension. Clarify the homogenate at 1300 g for 20 minutes at 4°C. Remove the supernatant fluid below the lipid layer and pass through a 0.45 µm filter. Maintain the filtrate at 4°C for immediate use or snapfreeze and store in aliquots at –80°C or in liquid nitrogen. Thaw the filtrate rapidly at 37°C and maintain on ice prior to use. Inject at least 12 juvenile (1–5 g) shrimp of a known susceptible species (P. monodon, P. esculentus, P. japonicus, P. merguiensis, P. vannamei, P. stylirostris), with 5 µl of filtrate per gram body weight into the second abdominal segment using a 26-gauge needle. Inject two equivalent groups of at least 12 shrimp with TN buffer and a filtered tissue extract prepared from uninfected shrimp. One additional group of at least 12 shrimp should be injected last with a known and calibrated positive control inoculum from shrimp infected with YHV or GAV (as required). Maintain each group of shrimp in a separate covered tank with a separate water supply for the duration of the bioassay. Ensure no inadvertent transfer of water between tanks by good laboratory practice. Observe the shrimp and record mortalities for at least 21 days or until the test and positive control groups reach 100% mortality. Collect at least one moribund shrimp from each of the four groups for examination by histology, TEM, in situ nucleic acid hybridisation, and PCR or Western-blot analysis to confirm the presence of YHV or GAV (as required) in the sample (refer to the Sections above for test procedures). NOTE: shrimp to be tested that are suspected of being carriers of low level chronic infections may produce an inoculum containing a very low dose of virus. In bioassay, such an inoculum may not necessarily cause mortalities, gross signs of disease or histology characteristic of a lethal infection. In this event, molecular tests (PCR or ISH) or TEM must be applied to the bioassay shrimp. 4.3.2.

Serological methods

Not applicable.

5.

Rating of tests against purpose of use The methods currently available for targeted surveillance and diagnosis of YHD are listed in Table 5.1. The designations used in the Table indicate: a = the method is the recommended method for reasons of availability, utility, and diagnostic specificity and sensitivity; b = the method is a standard method with good diagnostic sensitivity and specificity; c = the method has application in some situations, but cost, accuracy, or other factors severely limits its application; and d = the method is presently not recommended for this purpose. These are somewhat subjective as suitability involves issues of reliability, sensitivity, specificity and utility. Although not all of the tests listed as category a or b have undergone formal standardisation and validation, their routine nature and the fact that they have been used widely without dubious results, makes them acceptable.

Table 5.1. Methods for targeted surveillance and diagnosis Targeted surveillance

Method Larvae

PLs

Juveniles

Adults

Gross signs

d

d

c

c

Presumptive diagnosis

Confirmatory diagnosis

c

d

Bioassay

d

d

d

d

c

b

Direct LM

d

d

d

d

a

d

Histopathology

d

d

c

c

a

d

Transmission EM

d

d

c

c

d

b

Antibody-based assays

d

d

c

c

a

b

DNA probes  in situ

d

d

c

c

b

a

PCR

a

a

a

a

a

a

Sequence

a

a

a

a

d

a

PLs = postlarvae; LM = light microscopy; EM = electron microscopy; PCR = polymerase chain reaction.

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Anexo 19 (cont.)

6.

Test(s) recommended for targeted surveillance to declare freedom from yellow head disease Nested RT-PCR (Section 4.3.1.2.3.1; Protocol 3) followed by confirmatory sequencing of the amplified PCR product is the prescribed method for declaring freedom. Two-step PCR negative results are required. The very rare case when a two-step PCR positive result cannot be confirmed by sequencing is also considered to be a negative result. As genetic recombination between genotypes can occur, the detection of any genotype is considered to be evidence of the presence of YHD.

7.

Corroborative diagnostic criteria 7.1. Definition of suspect case A suspect case of YHD is defined as a disease outbreak in marine shrimp with rapidly accumulating mortalities (up to 100%) in the early to late juvenile stages, which may be preceded by cessation of feeding and congregation of shrimp at pond edges. Moribund shrimp may exhibit a bleached overall appearance and a yellowish discoloration of the cephalothorax caused by the underlying yellow hepatopancreas. Histological examination of fixed lymphoid organ tissues should reveal moderate to large numbers of deeply basophilic, evenly stained, spherical, cytoplasmic inclusions (approximately 2 µm in diameter or smaller). 7.2. Definition of confirmed case YHD may be confirmed by the detection of high levels of disseminated infection in tissues of ectodermal and mesodermal origin by in situ hybridisation in conjunction with the detection of amplified products of the prescribed size using discriminatory RT-PCR assays and sequencing, as described in Section 4.3 of this chapter. As low-level chronic infections with yellow head complex viruses are common in some regions, detection of the presence of virus is not, in itself, evidence of aetiology.

8.

References

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OF GILL-ASSOCIATED

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Anexo 19 (cont.)

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AND

DIAGNOSTIC PROCEDURES

FOR

DISEASES

OF

PENAEID SHRIMP.

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MOURILYAN

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(1997). A

YELLOW-HEAD-LIKE VIRUS FROM

SPANN K.M. DONALDSON R.A. COWLEY J.A. & WALKER P.J. (2000). DIFFERENCES IN SUSCEPTIBILITY OF SPECIES TO GILL-ASSOCIATED VIRUS (GAV) INFECTION. DIS. AQUAT. ORG., 42, 221–225.

PENAEUS

MONODON

SOME PENAEID PRAWN

SPANN K.M., MCCULLOCH R.J., COWLEY J.A. & WALKER P.J. (2003). DETECTION OF GILL-ASSOCIATED VIRUS (GAV) BY IN SITU HYBRIDISATION DURING ACUTE AND CHRONIC INFECTIONS IN PENAEUS MONODON AND PENAEUS ESCULENTUS SHRIMP. DIS. AQUAT. ORG., 56, 1–10.

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133 

Anexo 19 (cont.)

STENTIFORD G.D., BONAMI J.R. & ALDAY-SANZ V. (2009). A CRITICAL REVIEW OF SUSCEPTIBILITY OF CRUSTACEANS TO TAURA SYNDROME, YELLOWHEAD DISEASE AND WHITE SPOT DISEASE AND IMPLICATIONS OF INCLUSION OF THESE DISEASES IN EUROPEAN LEGLISLATION. AQUACULTURE, 291, 1–17.

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AUSTRALIAN GILL-ASSOCIATED VIRUS WITH A

TIRASOPHON W., YODMUANG S., CHINNIRUNVONG W., PLONGTHONGKUM & PANYIM S. (2007). THERAPEUTIC INHIBITION OF YELLOW HEAD VIRUS MULTIPLICATION IN INFECTED SHRIMPS BY YHV-PROTEASE DSRNA. ANTIVIRAL RES., 74, 150–155.

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WIJEGOONAWARDANE P.K.M., COWLEY J.A., SITTIDILOKRATNA, N., PHETCHAMPAI, N., COWLEY, J.A., GUDKOVS, N. & WALKER P.J. (2009). HOMOLOGOUS GENETIC RECOMBINATION IN THE YELLOW HEAD COMPLEX OF NIDOVIRUSES INFECTING PENAEUS MONODON SHRIMP. VIROLOGY DOI: 1016/J.VIROL.2009.04.015.

WIJEGOONAWARDANE P.K.M., COWLEY J.A., PHAN T., HODGSON R.A.J., NIELSEN L., KIATPATHOMCHAI W. & WALKER P.J. (2008A). GENETIC DIVERSITY IN THE YELLOW HEAD NIDOVIRUS COMPLEX. VIROLOGY 380, 213–225.

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RT-NESTED PCR

TO DETECT YELLOW HEAD

WONGTEERASUPAYA C., BOONSAENG V., PANYIM S., TASSANAKAJON A., WITHYACHUMNARNKUL B. & FLEGEL T.W. (1997). DETECTION OF YELLOW-HEAD VIRUS (YHV) OF PENAEUS MONODON BY RT-PCR AMPLIFICATION. DIS. AQUAT. ORG., 31, 181–186.

WONGTEERASUPAYA C., SRIURAIRATANA S., VICKERS J.E., AKRAJAMORN A., BOONSAENG V., PANYIM S., TASSANAKAJON A., WITHYACHUMNARNKUL B. & FLEGEL T.W. (1995). YELLOW-HEAD VIRUS OF PENAEUS MONODON IS AN RNA VIRUS. DIS. AQUAT. ORG., 22, 45–50.

* * *

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Anexo 20

CHAPTER 2.4.7.

INFECTION WITH PERKINSUS OLSENI 1.

Scope For the purpose of this chapter, infection with Perkinsus olseni is considered to be infection with P. olseni. Perkinsus atlanticus is considered to be a junior synonym.

2.

Disease information ... 2.2. Host factors 2.2.1.

Susceptible host species

Perkinsus olseni has an extremely wide host range. Known hosts include the clams Anadara trapezia, Austrovenus stutchburyi, Ruditapes decussatus, R. philippinarum, Tridacna maxima, T. crocea, Protothaca jedoensis and Pitar rostrata (Goggin & Lester, 1995; Villalba et al., 2004; Cremonte et al., 2005; Park et al., 2006; Sheppard & Phillips, 2008); oysters Crassostrea gigas, Crassostrea C. ariakensis, and C. sikamea (Villalba et al., 2004); pearl oysters Pinctada margaritifera, P. martensii, and P. fucata (Goggin & Lester, 1995; Sanil et al., 2010); abalone Haliotis rubra, H. laevigata, H. scalaris, and H. cyclobates (Goggin & Lester, 1995). Other bivalve and gastropod species might be susceptible to this parasite, especially in the known geographical range. Members of the families Arcidae, Malleidae, Isognomonidae, Chamidae and Veneridae are particularly susceptible, and their selective sampling may reveal the presence of P. olseni when only light infections occur in other families in the same habitat. ...

8.

References

. . .   GOGGIN C.L. & LESTER R.J.G. (1995). PERKINSUS, A PROTISTAN PARASITE OF ABALONE IN AUSTRALIA: A REVIEW. AUST. J. MAR. FRESHWATER RES., 46, 639–646. ... SANIL N.K., VIJAYAN K.K., KRIPA V. & MOHAMED K.S. (2010). OCCURRENCE OF THE PROTOZOAN PARASITE, PERKINSUS OLSENI IN THE WILD AND FARMED PEARL OYSTER, PINCTADA FUCATA (GOULD) FROM THE SOUTHEAST COAST OF INDIA. AQUACULTURE, 299, 8– 14. ... * * *

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Anexo 21

Evaluación de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda  (AHPND por sus siglas en inglés) para integrar la lista en el Código Sanitario para los animales acuáticos La Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos efectuó una evaluación de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) en función de los criterios para inscripción de una enfermedad de los animales acuáticos en la lista de la OIE indicados en el Artículo 1.2.2. del Código acuático, y acordó que esta enfermedad cumplía con los criterios 1, 4, 6, 7 y 8 (ver Cuadro 1 a continuación). Cuadro 1. Resumen de la evaluación de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda Criterios de la lista

Necrosis hepatopancreática aguda

Conclusión

1

2

3

4

5

6

7

8

+

NA

NA

+

NA

+

+

+

Inclusión en la lista

NA = no aplicable. A.

CONSECUENCIAS

Criterio No. 1. Se ha demostrado que la enfermedad causa pérdidas significativas de producción a nivel nacional o multinacional (zonas o regiones). Entre las especies huésped afectadas se encuentran Penaeus vannamei, P. monodon y P. chinensis (FAO, 2013), importantes en términos económicos para la cría del camarón. Desde 2010, se ha registrado un aumento de las pérdidas en la producción del camarón en China (República Popular de), Vietnam y Tailandia. Estas pérdidas se han asociado al síndrome de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPNS) (Lightner et al., 2012; Flegel, 2012; FAO, 2013), ahora denominada enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND). En 2011, se registraron pérdidas de más del 80% de la producción de camarones en las provincias chinas de Hainan, Guangdong, Fujian y Guangxi (Leano y Mohan, 2012). La enfermedad también afectó la producción de camarones en Vietnam, Malasia, Tailandia y México (Leano y Mohan, 2012; FAO, 2013; Joshi et al., 2014; Gomez-Gil et al., 2014). B.

PROPAGACIÓN

Criterio No. 4. Se ha demostrado la etiología infecciosa de la enfermedad. Vibrio parahaemolyticus es el agente causal de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) (Tran et al., 2013; Gomez-Gil et al., 2014). Aislados de V. parahaemolyticus de camarones afectados con AHPND han demostrado causar un alto grado de mortalidad en camarones infectados experimentalmente (Zhang et al., 2012; Tran et al., 2013; Gomez-Gil et al., 2014; Joshi et al., 2014). Los camarones infectados experimentalmente desarrollaron patologías características de la necrosis hepatopancreática aguda (Joshi et al., 2014; Tran et al., 2013) y la bacteria nuevamente aislada demostró inducir la enfermedad en las subsiguientes infecciones experimentales (Tran et al., 2013). La enfermedad se transmitió experimentalmente por inmersión e inyección intramuscular (Tran et al., 2013; Joshi et al., 2014). Criterio No. 6. Probabilidad de propagación internacional de la enfermedad por los animales vivos, sus productos o fomites El comercio internacional de especies de camarones susceptibles a la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda es significativo. Las mercancías comercializadas incluyen animales vivos como larvas de camarón y material de reproducción. Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

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Anexo 21 (cont.) Pruebas experimentales de la transmisión de la necrosis hepatopancreática aguda indican que las mercancías infectadas representan una vía de introducción y propagación de la enfermedad (ver Criterio No. 7). El modelo de notificación de la necrosis hepatopancreática aguda en el mundo indica una propagación internacional. La AHPND se notificó en China (República Popular de) y Vietnam en 2010. La distribución de la enfermedad en estos países continuó progresando en 2010. A finales de 2010, la mortalidad de los camarones asociada a la AHPND se notificó en las provincias costeras de Vietnam. La enfermedad se notificó en Malasia en 2011 y Tailandia en 2012 (FAO, 2013) con una expansión en constante evolución. La necrosis hepatopancreática aguda se registró también en México a principios de 2013 (Gomez-Gil et al., 2014). Criterio No. 7. Varios países o zonas pueden ser declarados libres de la enfermedad, de conformidad con los principios generales de vigilancia descritos en el Capítulo 1.4. del Código acuático. La AHPND se ha notificado asociada con una mortalidad de masa durante los primeros 20-30 días del cultivo de camarones. Existen numerosos países con especies susceptibles que no han notificado mortalidad o patología que corresponda con la necrosis hepatopancreática aguda. Por lo tanto, es probable que las formas patógenas de Vibrio parahaemolyticus que causan la necrosis hepatopancreática aguda estén ausentes en dichos países. La disponibilidad de pruebas de diagnóstico molecular específicas y sensibles para las formas de V. parahaemolyticus que causan la necrosis hepatopancreática aguda permitirán demostrar la ausencia de la enfermedad. C.

DIAGNÓSTICO

Criterio No. 8. Existe un método de diagnóstico o de detección fiable y asequible. Existe información disponible sobre los métodos de diagnóstico para la AHPND incluyendo la histopatología (Lightner et al., 2012) y los métodos moleculares (Flegel y Lo, 2013). Una primera prueba PCR llamada AP3 desarrollada por Sirikharin et al. (2014) puede diferenciar la necrosis hepatopancreática aguda causada por V. parahaemolyticus de la forma no patógena. Referencias FAO (2013). Report of the FAO/MARD Technical Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) or Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) of Cultured Shrimp (under TCP/VIE/3304). Hanoi, Viet Nam, 25–27 June 2013. FAO Fisheries and Aquaculture Report No. 1053. Rome. 54 pp. Flegel, T.W. (2012). Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. Journal of Invertebrate Pathology 110: 166‒173. Flegel T.W., Lo G. 2013. [http://www.enaca.org/modules/library/publication.php?publication_id=1128 Accessed on 4 October 2014.] Gomez-Gil B., Soto-Rodríguez S., Lozano R., Betancourt-Lozano M. 2014. Draft genome sequence of Vibrio parahaemolyticus strain M0605, which causes severe mortalities of shrimps in Mexico. Genome Announcement 2(2):e00055-14. doi:10.1128/genomeA.00055-14. Joshi J., Srisala J., Truong V.H., Chen I-T., Nuangsaeng B. Suthienkul O., Lo C.F., Flegel T.W., Sritunyalucksana K., Thitamadee S. (2014). Variation in Vibrio parahaemolyticus isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). Aquaculture (428–429): 297‒302. Leaño, E.M. and Mohan, C.V. (2012). Early Mortality Syndrome (EMS)/Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS): An emerging threat in the Asian shrimp industry. Global Aquaculture Advocate July/August 2012: 38‒39.

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139 

Anexo 21 (cont.)

Lightner DV., Redman RM., Pantoja CR., Noble BL., Tran LH., 2012. Early mortality syndrome affects shrimp in Asia. Global Aquaculture Advocate Jan/Feb 2012: 40. Sirikharin, R., Taengchaiyaphum, S., Sritunyalucksana1, K., Thitamadee, S., Flegel, T.W., Mavichak, R., Proespraiwong, P. (2014). A new and improved PCR method for detection of AHPND bacteria. [Accessed from http://www.enaca.org/modules/news/article.php?article_id=2030&title=new-pcr-detection-method-for-ahpnd on 4 October 2014.] Tran L., Nunan L., Redman R.M., Mohney .LL., Pantoja C.R., Fitzsimmons K., Lightner D.V. (2013). Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 106: 45‒55. Zhang B-C., Liu F., Bian H-H., Liu J., Pan L-Q., Huang J. 2012. Isolation, identification, and pathogenicity analysis of a Vibrio parahaemolyticus strain from Litopenaeus vannamei. (Chinese J.) Progress in Fishery Sciences, 33: 56‒62.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

141 

Anexo 22

CAPÍTULO 11.6.

INFECCIÓN POR PERKINSUS OLSENI Artículo 11.6.1. A efectos del Código acuático, la infección por Perkinsus olseni es la infección debida exclusivamente a P. olseni. La información sobre los métodos de diagnóstico figura en el Manual Acuático. Artículo 11.6.2. Ámbito de aplicación Las recomendaciones de este capítulo se aplican a las siguientes especies: las almejas (Austrovenus stutchburyi, Venerupis pullastra, V. aurea, Ruditapes decussatus y R. philippinarum), la oreja de mar (Haliotis rubra, H. laevigata, H. cyclobates y H. scalaris) y otras especies (Anadara trapezia, Barbatia novaezelandiae, Macomona liliana, Paphies australis, Crassostrea gigas y C. ariakensis). Estas recomendaciones se aplican también a todas las demás especies susceptibles mencionadas en el Manual Acuático que sean objeto de comercio internacional. […]

-------------Texto suprimido.

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

143

Anexo 23 PROGRAMA DE TRABAJO 2014–2015 DE LA COMISIÓN PARA LOS ANIMALES ACUÁTICOS Código acuático Tarea

Septiembre de 2014

Guía del usuario

Examen de los comentarios Examen de los de los Países miembros y comentarios de los Países miembros nueva circulación para comentario

Presentación para aprobación

Glosario

Revisión de algunas definiciones y circulación para comentario de los Países miembros

Examen de los comentarios de los Países miembros

Presentación para aprobación

Artículo 1.1.5. (Capítulo 1.1.)

Revisión del Artículo 1.1.5. Examen los comentarios Presentación para de los Países miembros aprobación y circulación para comentario de los Países miembros

Revisión del Título 4 para mejorar las orientaciones en materia de control de enfermedades

Capítulo 4.3. Recomendaciones generales sobre desinfección

Marzo de 2015

SG mayo de 2015 Septiembre de 2015

Desarrollo de un plan a partir de las recomendaciones de la conferencia sobre animales acuáticos Revisión del proyecto de capítulo y circulación para comentario de los Países miembros

Revisión del informe del grupo ad hoc y del proyecto de capítulo sobre desinfección. Solicitud al Grupo ad hoc para que finalice el capítulo

Examen de los Capítulo 4.X. Recomendaciones para la Revisión del informe del desinfección de los huevos de grupo ad hoc y del proyecto comentarios de los salmónidos Países miembros de capítulo sobre la desinfección de los huevos de salmónidos y circulación para comentario de los Países miembros

Presentación para aprobación

Revisión del Capítulo 4.7. y Examen de los circulación para comentario comentarios de los Países miembros de los Países miembros

Presentación para aprobación

Capítulo 6.6. Análisis del riesgo de la Revisión del proyecto de resistencia a los agentes Capítulo 4.7. y circulación antimicrobianos en acuicultura (nuevo) para comentario de los Países miembros

Examen de los comentarios de los Países miembros

Presentación para aprobación

Inclusión de especies susceptibles en capítulos específicos de enfermedad

Convocación de un grupo ad hoc para aplicar los criterios tomando como referencia la enfermedad de la cabeza amarilla

Revisión del informe de grupo ad hoc y proponer modificaciones al Capítulo 9.2.2.

Necrosis hepatopancreática aguda (AHPND)

Propuesta de inscripción de Examen de los comentarios de los la necrosis hepatopancreática aguda y Países miembros circulación de la evaluación para comentario de los Países miembros

Capítulo 4.7. Control de peligros asociados a los alimentos de los animales acuáticos

Examen de los comentarios de los Países miembros

Presentación para Si se adopta la aprobación inscripción, redacción de un nuevo capítulo

 

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

144

Anexo 23 (cont.)

Manual acuático Tareas

Septiembre de 2014

Febrero de 2015

Capítulos sobre los crustáceos: enfermedad de la cabeza amarilla, hepatopancreatitis necrotizante, síndrome de Taura, necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa Capítulo 1.1.3. Métodos de desinfección de los establecimientos de acuicultura

Examen de los Propuesta de comentarios de los modificaciones y Países miembros circulación para comentario de los Países miembros Propuesta de supresión si se adopta el nuevo capítulo 4.X. del Código acuático

Inclusión de especies susceptibles en capítulos específicos de enfermedad

SG mayo de 2015

Septiembre de 2015

Presentación para aprobación

Propuesta de supresión si se adopta el nuevo capítulo 4.X. del Código acuático

Propuesta de supresión si se adopta el nuevo capítulo 4.X. del Código acuático Revisión del informe del grupo ad hoc y propuesta de modificaciones en la Sección 2.2.1. del Capítulo 2.2.8. sobre la enfermedad de la cabeza amarilla

Examen de los comentarios de los Países miembros

Revisión del informe del grupo ad hoc y del proyecto de capítulo y circulación para comentario de los Países miembros

Examen de los comentarios de los Países miembros

Capítulo sobre necrosis hepatopancreática aguda (AHPND)

Acuerdo para convocar un grupo ad hoc con el fin de redactar un nuevo capítulo sobre necrosis hepatopancreática aguda (AHPND)

Validación de las pruebas de diagnóstico

Solicitud de envío de una Análisis de la evolución carta a los autores del capítulo del Manual con respecto a las pruebas de validación

Secciones sobre estabilidad del agente Solicitud de envío de una Examen de los avances (asociada a la desinfección) carta a los autores del capítulo del Manual solicitando revisión de la información sobre la estabilidad del agente

Otras cuestiones Tareas

Septiembre de 2014

Conferencia Mundial de la OIE sobre Revisión de los Sanidad de los Animales Acuáticos resúmenes (enero de 2015, especificación pendiente) Conferencia de los Laboratorios de Referencia de la OIE (7-9 de octubre de 2014)

Enero de 2015

Febrero-Abril de 2015

Conferencia (20-22 de enero de 2015, Vietnam)

Revisión de las ponencias

Presentación de comentarios sobre el programa y el Comité Científico

Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos / septiembre-octubre de 2014 

 

©

Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), 2014 El presente documento fue preparado por especialistas a solicitud de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Excepto en el caso de su adopción por la Asamblea Mundial de Delegados, lo expresado refleja únicamente las opiniones de dichos especialistas. Todas las publicaciones de la OIE están protegidas por un Copyright internacional. Se pueden copiar, reproducir, traducir, adaptar o publicar extractos en publicaciones periódicas, documentos, libros o medios electrónicos y en cualquier otro medio destinado al público, con intención informativa, didáctica o comercial, siempre y cuando se obtenga previamente una autorización escrita por parte de la OIE. Las designaciones y nombres utilizados y la presentación de los datos que figuran en esta publicación no constituyen de ningún modo el reflejo de cualquier opinión por parte de la OIE sobre el estatuto legal de los países, territorios, ciudades o zonas ni de sus autoridades, fronteras o límites territoriales. La responsabilidad de las opiniones profesadas en los artículos firmados incumbe exclusivamente a sus autores. La mención de empresas particulares o de productos manufacturados, sean o no patentados, no implica de ningún modo que estos se beneficien del apoyo o de la recomendación de la OIE, en comparación con otros similares que no hayan sido mencionados.

   

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