Lineamientos para la Vigilancia por Laboratorio de Enfermedad de

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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DE CHAGAS InDRE – RNLSP 2012

Enfermedad de Chagas Versión No.01

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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS

SECRETARIA DE SALUD SALOMÓN CHERTORIVSKI WOLDENBERG SECRETARIO DE SALUD DR. PABLO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDÁN DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO LIC. JESÚS OMAR CASTILLO HERNÁNDEZ SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA QC. ISRAEL PARRA ORTEGA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE PRUEBAS

BIOL. SERGIO PASTEN SANCHEZ JEFE DEL LABORATORIO DE CHAGAS COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNOSTICO DE CHAGAS

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ÍNDICE INTRODUCCION ................................................................................................................ 4 ANTECEDENTES ............................................................................................................... 5 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD DE CHAGAS ............................................................................................................................. 7 MARCO LEGAL DEL LABORATORIO .............................................................................. 7 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 8 Objetivo General ............................................................................................................................ 8 Objetivos Específicos .................................................................................................................... 8

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE CHAGAS .............. 8 FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD DE CHAGAS . 10 Funciones del laboratorio a nivel federal.................................................................................. 10 Funciones de los laboratorios estatales. (LESP) ..................................................................... 11 Funciones de los laboratorios a nivel local .............................................................................. 12

DEFINICIONES OPERATIVAS......................................................................................... 12 Caso Sospechoso ........................................................................................................................ 12 Caso Probable .............................................................................................................................. 12 Caso Confirmado ......................................................................................................................... 13 Caso Descartado .......................................................................................................................... 13

TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS .................................................................... 14 ALGORITMO DE DIAGNÓSTICO DE LA TRIPANOSOMIASIS AMERICANA ............... 16 ESTÁNDARES DE CALIDAD .......................................................................................... 39 CAPTURA DE DATOS Y RESULTADSOS ...................................................................... 40 PROGRAMA DE EVALUACION EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) SEROCHAGAS .......................................................................................................................................... 40 CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO ............................................ 42 BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO .............................................................................. 43 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................................ 44 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................ 45 Anexo I: CARACTERISTICAS DE EQUIPOS COMERCIALES ...................................... 47 Anexo II: PREPARACION DE REACTIVOS .................................................................... 48

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INTRODUCCION La enfermedad de Chagas es autoctona del continente americano. Es causada

por

el

protozoario

hemoflagelado

Trypanosoma

cru zi ,

y

se

transmite a humanos principalmente por triatominos hematófagos o por transfusión sanguínea. Se ha estimado que de 16 a 18 mil lones de individuos estaban infectados con T. cru zi a principios de los 1990s (W HO, 1991) sin embargo, gracias al éxito de las intervenciones para el control vectorial y el tamizaje en donadores de sangre las cifras han disminuido (Schmunis, 1999). Se estima, que 120 millones de individuos continúan en riesgo de adquirir la infección. En México, los triatominos fueron reportados por primera vez en 1928 (Hoffman, 1928) y el primer caso humano fue descrito 12 años más tarde (Mazzotti, 1940). La transmisión v ectorial de T. cru zi se lleva a cabo en dos ecosistemás. Uno relacionado con triatominos selváticos y mamíferos silvestres (ciclo selvático), el otro asociado a la vivienda humana con la participación del vector que habita la vivienda o en el peridomicilio en directa relación con animales domésticos y el hombre (ciclo doméstico) (Pinto -Dias, 1992). El control y prevención de la enfermedad depende del conocimiento existente sobre su magnitud, trascendencia, vulnerabilidad. En México el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiologica (SINAVE) es un programa de acción conformado por un conjunto de estrate gias y acciones que permiten identificar y detectar los daños y riesgos para la salud, su importancia radica en la capacidad de generar información útil para la orientación del Programa de Enfermedades Transmitidas por Vector. El presente documento establ ece los lineamientos de operación para la vigilancia basada en el laboratorio de la enfermedad de Chagas, incluyendo las funciones por niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de muestras (métodos convencionales y no Enfermedad de Chagas Versión No.01

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convencionales);la evaluación del desempeño así como los estándares de calidad. ANTECEDENTES Los antecedentes del Laboratorio de Enfermedad de Chagas se remontan a la creación en 1939 del Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET) y los trabajos del Dr. L. Mazzotti que fueron continuados por el Dr. A. Dávalos quien durante años confirmo casos de Chagas agudos detectados por microscopistas del Centro Nacional de la Erradicación del Paludismo (CNEP). El Laboratorio de Tripanosomátidos se crea en 1983 como parte del Departamento de Parasitología y en ese año, se inician estudios epidemiológicos sobre esta tripanosomiasis. En 1985 el laboratorio estaba participando en las encuestas epidemiológicas en zonas rurales de varias entidades federativas y otros estudios de seroprevalencia en bancos de sangre. En los 80’s también se promueve la creación de ceparios para Leishmania spp como Trypanosoma cruzi. En apoyo al diagnóstico

de

esta

infección,

se

desarrollan

técnicas

serológicas,

utilizando

preparaciones antigénicas propias y las técnicas de inmunofluorescencia indirecta, tanto para Leishmaniosis como para Tripanosomiasis Americana, fueron establecidas como metodologías de referencia. En 1989 se lleva al cabo la transferencia de tecnología del Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén”, Laboratorio de Referencia de la OPS/OMS a este laboratorio. En los años de 1987 a 1990, el laboratorio participó en la Encuesta Nacional Seroepidemiológica, que evidenció la distribución geográfica de la enfermedad y su prevalencia. En 1994 el Laboratorio de Tripanosomatidos fue dividido en el Laboratorio de Enfermedad de Chagas y el Laboratorio de Leishmaniosis y es así como se encuentran en la actualidad. Durante estos años, también se impulsa el tamizaje de hemodonadores; se crea la Red Nacional de Laboratorios de Enfermedad de Chagas (RNLECh) que opera con el binomio Hemaglutinación Indirecta-Inmunofluorescencia Indirecta (HAI-IFI). En 1998 surge la necesidad de resolver la discordancia entre ambas pruebas y se implementa el Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés). A inicios de este siglo, se cuenta con la suficiencia diagnóstica y se implementa el algoritmo de referencia para diagnostico, referencia y control de calidad. Además, se implementa un protocolo para la verificación de parámetros operativos de diagnóstico Enfermedad de Chagas Versión No.01

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serológico utilizando los estuches comerciales disponibles en México, con esta información se apoya a los LESP enla correcta selección de reactivos. La técnica de Inmunoelectrotransferencia (Western Blot) se implementa en el año 2002 como apoyo al algoritmo de diagnóstico y referencia, en casos particulares. Tres años después, surge la necesidad de evaluar

el desempeño de los integrantes de la Red Nacional de

Laboratorios de Salud Pública y en 2005 la participación en el Boletín Caminando a la Excelencia, como herramienta para identificar áreas de oportunidad en el desempeño de los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). En 2008, se elaboran paneles de eficiencia siguiendo lineamientos estandarizados y se implementa el programa de evaluación externa del desempeño (PEED SEROCHAGAS) con dos ejercicios anuales. De 2008 a la fecha, se ha fortalecido el algoritmo de diagnóstico, con el uso de equipos comerciales de alto desempeño.

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RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD DE CHAGAS Fig. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de Chagas en México.

Marco analítico existente en la RNLSP para el Diagnostico Serológico de Chagas

En color rojo se presentan los estados que realizan una prueba, amarillo dos pruebas y verde al menos tres pruebas. En negro se indica los estados que no realizan el diagnóstico o están en proceso de implementación.

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO 1) Ley General de Salud. 2) Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2010 para la vigilancia epidemiológica. 3) Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010 para la Vigilancia Epidemiología, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector.

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OBJETIVOS Objetivo General Generar información básica para apoyar las actividades del programa de Enfermedades Transmitidas por Vector (ETV) y promover la creación de sinergias de actuación para realizar el diagnóstico de la tripanosomiasis americana. Objetivos Específicos  Generar información oportuna y valida mediante la utilización de algoritmos de diagnóstico validados. 

Generar servicios de diagnóstico confiables mediante la participación en el programa de evaluación externa del desempeño.



Incrementar el desempeño técnico de los recursos humanos de la RNLSP mediante la capacitación continua y específica a las necesidades particulares.



Demostrar nuestra competencia técnica, fomentando la cultura de calidad y mejora continua de nuestros procesos.

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE CHAGAS La red está constituida por tres niveles: federal, estatal y local: El nivel federal está representado por el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE). El nivel estatal está constituido por los Laboratorios Estatales o Regionales de Salud Pública (LESP) que cuentan con las técnicas serológicas para el diagnóstico de la enfermedad. El nivel local está integrado por los laboratorios ubicados en centros de salud, en hospitales y en cabeceras jurisdiccionales. En cada estado puede haber tantos laboratorios locales como sean necesarios para resolver las necesidades de diagnóstico en apoyo a la vigilancia epidemiológica y a las actividades de salud pública. Los laboratorios de nivel local apoyan el diagnóstico de enfermedades de importancia epidemiológica y se integran en redes específicas de diagnóstico. La coordinación de la RNLSP la ejerce InDRE que interacciona con los LESP, quienes a su vez, son los enlaces funcionales entre los laboratorios del nivel local y el de nivel nacional. Los laboratorios de apoyo al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE) se deben coordinar con los de la RNLSP, en el nivel correspondiente.

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Fig 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública

Fuente: Congreso AMIMC. Dra. Celia M. Alpuche Aranda Mayo, 2008

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FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD DE CHAGAS Funciones del laboratorio a nivel federal EL laboratorio de Chagas en el InDRE es el Laboratorio de Referencia Nacional para los laboratorios del SINAVE y es el órgano normativo para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Sus funciones son: 

Efectuar el diagnóstico serológico y parasitológico de la Enfermedad de Chagas.



Consolidar los algoritmos de referencia y criterios de interpretación de resultados.



Realizar las pruebas de control de calidad en el diagnóstico parasitológico y serológico, apoyado a nivel estatal, por los LESP. El control de calidad se realizará con el total de las muestras biológicas positivas y el 10% de las negativas1



Transferir tecnología estandarizada a los laboratorios integrantes de la Red, Técnica de Inmunofluorescencia indirecta (IFI).



Ofrecer biológicos como, antígeno IFI y sueros control.



Verificar las características operativas de estuches comerciales como apoyo a la RNLSP en la selección de reactivos.



Preparar y enviar paneles de eficiencia (PEED SEROCHAGAS) a los LESP participantes.



Capacitar en servicio para la formación de recursos humanos en la prestación de un servicio eficiente.



Implementar y adecuar nuevas técnicas de diagnóstico en apoyo al algoritmo de referencia.



Desarrollar investigación aplicada en apoyo a la vigilancia epidemiológica.



Generar información de orden nacional, integrando y siendo el rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, en materia de diagnóstico, investigación y desarrollo tecnológico para la vigilancia epidemiológica para la toma de decisiones en el control de la enfermedad que incidan en la formulación y orientación del programa nacional de salud.

1

NOM-032-SSA2-2010, Control de calidad del diagnóstico, numeral 7.3.2.5..

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Funciones de los laboratorios estatales. (LESP)  Participar en las actividades de vigilancia epidemiológica mediante la realización de las pruebas de diagnóstico serológico con estuches comerciales verificados o metodología estandarizada previamente, en el InDRE, de la cual ha recibido capacitación el personal de los LESP. 

Proporcionar a otras Instituciones de salud los formatos y lineamientos establecidos en InDRE para la toma y envío de muestras al LESP, que garanticen la calidad y cantidad de muestra que ingresa a la RNLSP.



Referir muestras al InDRE para la realización de pruebas generales, especializadas y de referencia, así como para control de calidad.



Referir al InDRE en volumen suficiente, el 100% de muestras positivas, el 10% de muestras negativas para control de calidad y conformación del Banco de Sueros.



Brindar supervisión y asesoría al personal delos laboratorios a nivel local.



Promover la utilización adecuada de las pruebas de diagnóstico y la interpretación de los resultados por medio de la capacitación realizada en cursos-taller, impartidos por personal del InDRE con el compromiso que la capacitación sea dinámica y de acuerdo a las tendencias y necesidades de la RNLSP.



Desarrollar, promover y apoyar acciones de capacitación e investigación para el mejoramiento integral de la RNLSP en el ámbito estatal.



Asegurar la estabilidad y confiabilidad del diagnóstico, mediante la implementación de un programa de control de calidad y la participación en el PEED SEROCHAGAS a través de los Paneles de Eficiencia, para evaluación de desempeño, dos veces por año.



Capacitar a los integrantes de la Red estatal de laboratorios para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas



Elaborar y llevar a cabo los programas operativos y de control de calidad en los laboratorios locales para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas.



Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos referentes a diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal y local.



Generar evidencia de la enfermedad de Chagas al notificar al órgano normativo estatal correspondiente los casos agudos, indeterminados y crónicos confirmados.

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Funciones de los laboratorios a nivel local  Realizar alguna de las pruebas convencionales (HAI, ELISA e IFI) para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas que requieren únicamente equipo básico de laboratorio. 

Referir muestras al LESP de su entidad para control de calidad y para la realización de las pruebas generales y especializadas o de referencia que no realicen en el laboratorio local.



Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos de enfermedad de Chagas confirmados: agudos, indeterminados y crónicos.



Recibir capacitación y asesoría del nivel estatal.



Aplicar las recomendaciones del nivel estatal.



Cumplir con el programa de control de calidad que establece el nivel estatal.

DEFINICIONES OPERATIVAS2 Caso Sospechoso Toda persona que refiera antecedentes de residencia o visita a zona endémica de Tripanosomiasis Americana y que presente alguna o varias de las siguientes características: que haya recibido sangre de donador seropositivo o componentes sanguíneos; con antecedente de trasplante de órganos; que sea hijo de madre seropositiva a T. cruzi o que presente algún síntoma inespecífico de la enfermedad. El caso sospechoso de Tripanosomiasis es totalmente inespecífico, por lo que su utilización debe abocarse para estudios de brotes y situaciones especiales. Caso Probable Persona que resida o provenga de zona endémica y que presente uno o varios de los siguientes signos o síntomas: 

Caso probable agudo: Chagoma de inoculación, fiebre intermitente prolongada, Signo de Romaña, cardiopatía y/o seropositividad a inmunoglobulina IgM en una de las siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.

2

Fuente: Lineamientos para la vigilancia epidemiológica de las Enfermedades Transmitidas por Vector. Grupo Técnico Interinstitucional del Comité Nacional para la Vigilancia Epidemiológica (CONAVE). Marzo 2012.

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Caso probable congénito: Hijo de madre seropositiva, prematurez, fiebre, hepatoesplenomegalia y/o linfadenopatias.



Caso probable post-transfusional: Cuadro compatible con Tripanosomiasis aguda, antecedentes de haber recibido sangre 3 meses antes de presentar la sintomatología y/o antecedentes de no haber realizado pruebas de tamizaje en el donador.



Caso probable indeterminado: Que presente serología positiva a una de las siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.



Caso probable crónico: Cardiopatía dilatada, megaesófago, megacolon y/o serología positiva a una de las siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.

Caso Confirmado Es la persona con signos o síntomas de la enfermedad en quien se demuestre la presencia

del

parásito

mediante

alguna

de

las

siguientes

pruebas:

estudios

parasitoscópicos (gota gruesa, frotis, hemoconcentración de muestras sanguíneas, cultivo en medios NNN) o serología positiva en la misma muestra de suero a por lo menos dos de las siguientes pruebas: IFI, HAI o ELISA, o cualquier técnica avalada por la instancia competente. Caso Descartado Es la persona en la que no se encuentra evidencia de T. cruzi por los procedimientos descritos.

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TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS Para la correcta identificación de cada muestra es imprescindible que cada una de ellas este rotulada en forma completa con los siguientes datos: a) Apellido y nombre b) Fecha de extracción de la muestra c) Demás datos necesarios según caso. 1.

La muestra de suero, sangre o laminilla (ver Tabla 1A y 1B) debe acompañarse del formato REMU-F-12, del resumen de historia clínica y de la solicitud del estudio.

2.

La falta de alguno de estos documentos o inconsistencia en la identificación precisa de la muestra será causa de rechazo. Se notificará al usuario, la muestra quedará en resguardo en él laboratorio y contará con un periodo de ocho días para enviar la documentación completa o corrección, de no ocurrir la muestra es desechada.

3.

La muestra no deberá estar hemolizada, contaminada, lipémica o contener alguna sustancia interferente. Si sucede, la muestra será rechazada de manera definitiva y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax.

4.

El diagnóstico serológico de la tripanosomiasis americana seguirá el algoritmo Los resultados serán emitidos para diagnóstico en 10 días, para referencia y control de calidad 15 días después de recibida la muestra.

5.

En casos especiales, si la muestra no cumple con los criterios de calidad biológica pero el usuario considera que la muestra es de alto valor deberá notificarlo al Laboratorio de Enfermedad de Chagas por escrito en la solicitud o formato y aceptar que el resultado debe ser interpretado con cautela, quedando el laboratorio del InDRE libre de toda responsabilidad legal.

ENVÍO Y RECEPCIÓN DE MUESTRAS El envío de muestras debe realizarse a la brevedad posible después de la obtención de la muestra y en no más de siete días hábiles. El tubo con la muestra de suero se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta y en un contenedor que cierre herméticamente y se envía de inmediato; se debe proteger de la luz solar y del calor excesivo con un refrigerante (4-8 °C), que no debe de estar en contacto directo con la muestra. En el caso de las dependencias de la Secretaría de Salud la muestra se envía al Laboratorio Estatal Enfermedad de Chagas Versión No.01

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de Salud Pública correspondiente. Para otras instituciones el envío se realizará de acuerdo con los procedimientos que se determine en el nivel estatal o federal. InDRE: Instructivo para la toma y envío de muestras biológicas para diagnóstico y control de calidad: http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/intd_manuales.html Toma y recepción de muestras InDRE: http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/tomayrecepcion.html

Tabla 1. Toma y manejo de muestras clínicas

A. Técnicas parasitoscopicas Tipo de muestra Sangre capilar

Sangre total

Sangre total

Sangre total

Sangre total

Método Por punción digital Por venopunción en tubos con heparina/EDTA Por venopunción en tubos con heparina/EDTA Por venopunción en tubos con heparina Por venopunción en tubos con heparina

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Medio/contenedor/forma de envío Extendido sobre vidrios porta objetos si es posible coloreado con Giemsa, muestra de sangre en laminilla a TA. 2 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C

2 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C.

3-5 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C.

2 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C.

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Tiempo Durante la fase aguda de la enfermedad. Durante la fase aguda de la enfermedad. Durante la fase aguda de la enfermedad. Durante la fase aguda de la enfermedad. Durante la fase aguda de la enfermedad.

Técnica Frotis, Gota gruesa

Frotis, Gota gruesa

Microhematocrito fluorescente

Hemocultivo

Inoculación en ratón

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B. Técnicas inmunoserológicas Tipo de muestra

Método

Medio/contenedor/forma de envío

Tiempo

Técnica ELISA Ag Totales

Suero

Por venopunción 1 mL, enviar con en tubos sin refrigerantes de 4 a 8 °C anticoagulantes

Durante la fase aguda tardía y crónica de la enfermedad

ELISA Ag Recombinantes IFI Parasito Integro WB

ALGORITMO DE DIAGNÓSTICO DE LA TRIPANOSOMIASIS AMERICANA El diagnóstico etiológico de la enfermedad de Chagas se basa en la evaluación clínica, epidemiología y pruebas de laboratorio. Para el diagnóstico de laboratorio, los exámenes adecuados dependen de la etapa clínica del paciente. En la etapa aguda los estudios se centran en la búsqueda y reconocimiento del Trypanosoma cruzi en sangre (metodología: parasitológica directa), porque en las etapas iníciales de la enfermedad se encuentran parasitemias importantes y a medida que transcurre la infección van disminuyendo hasta hacerse mínimas y aleatorias. En las etapas crónicas (inaparente o indeterminada y sintomática) las parasitemias son transitorias y por ello el diagnóstico se realiza fundamentalmente mediante el hallazgo de anticuerpos circulantes contra el T. cruzi. 1. INMUNODIAGNÓSTICO

El inmunodiagnóstico se basa en la detección de anticuerpos específicos contra el Trypanosoma cruzi sin embargo, se debe tener bien entendido que lo que se busca no es el parásito y por tanto sus resultados nunca proporcionarán certeza diagnóstica y deben evaluarse en términos de probabilidad. Para que la probabilidad se acerque a la certeza, es importante seleccionar adecuadamente el método a emplear, el momento de la toma de muestra y la interpretación apropiada de los resultados. El diagnóstico de laboratorio se realiza en una muestra de sangre o suero del paciente, el tipo de muestra se determina en base a la fase de la enfermedad y la técnica a realizar. Se debe obtener una muestra de sangre completa por venopunción [(aproximadamente 5 Enfermedad de Chagas Versión No.01

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mililitros (mL)] en un tubo con o sin anticoagulante. Para inmunodiagnóstico se utiliza suero, en fase crónica, para técnicas de cultivo o inoculación en modelo animal es sangre completa o laminillas con extendido y gota gruesa para técnicas parasitoscópicas, será enviado al LESP para el ensayo. La muestra de suero debe mantenerse siempre en refrigeración (2-8 °C) desde la toma hasta la llegada al LESP. La muestra deberá venir acompañada con el Formato envío debidamente completado, sin datos alterados o sobre escritos y en caso de considerarlo

conveniente, por favor

indique la gravedad del

paciente; las muestras que no cumplan con los requisitos establecidos, serán rechazadas. De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA-2010, para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por vector, el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana se basa en el cuadro clínico del paciente, asociado a las fases aguda y crónica del padecimiento; antecedentes de residencia en áreas endémicas de la enfermedad, transfusional, madre chagásica y/o trasplante de órganos. “Se confirma el diagnóstico en fase aguda, al demostrar la presencia del Trypanosoma cruzi o serología positiva en la sangre, por estudio directo o por la técnica de concentración de Strout, cultivo o xenodiagnóstico, serología positiva (HAI, IFI, ELISA y Aglutinación de Partículas) en fase aguda tardía. En fase indeterminada, se confirma por serología positiva y en fase crónica por serología positiva o el xenodiagnóstico y el cultivo en sangre en medios bifásicos al dar resultados positivos” de acuerdo a lo que especifica la NOM-032-SSA-2010. La confirmación del diagnóstico por laboratorio se establece por la demostración del parásito o bien por al menos dos pruebas serológicas de diferente formato, positivas. Los servicios de salud instalados en áreas endémicas, donde la población está en riesgo de contraer la parasitosis, deben tener conocimiento, para establecer el diagnóstico clínico, parasitológico y serológico. Los criterios de laboratorio para la clasificación de casos son de acuerdo a la siguiente tabla.

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Tabla 2. El diagnóstico de la enfermedad de Chagas se realiza por criterios clínico, epidemiológicos y principalmente con ayuda de métodos parasitológicos o serológicos.

Parásitos cualquier método

Serología Dos Pruebas

Sintomatología

Criterio Diagnóstico de Caso

+

+

+

Agudo

+

-

+

Agudo

-

+

+

Agudo

+

+

-

Indeterminado

-

+

-

Indeterminado

-

+

+

Crónico

-

-

+

No caso

El inmunodiagnóstico de la infección por Trypanosoma cruzi involucra una mezcla de anticuerpos dirigidos contra un gran número de antígenos parasitarios, con diferente concentración, afinidad y antelación de aparición. Puede haber expresión de diferentes mosaicos antigénicos entre las distintas cepas y reactividad cruzada con microorganismos relacionados que comparten zonas geográficas. Los distintos métodos y estuches de reactivos pueden comportarse de manera diferente frente a una misma muestra y la evaluación de desempeño de diferentes lotes no son siempre consistentes con estudios previos. La especificidad del inmunodiagnóstico para la tripanosomiasis americana es buena sin embargo, la sensibilidad es mayor hacia la fase crónica sintomática. Los antígenos en los estuches comerciales o reactivos de elaboración casera son obtenidos a partir de diferentes cepas y fases del parásito, van desde el parásito íntegro, extractos crudos, extractos parcialmente purificados, antígenos recombinantes de fase aguda o crónica, péptidos sintéticos, hasta antígenos quiméricos. Los estuches de diagnóstico son muy variables en su composición antigénica y ninguno de ellos alcanzan por sí solo el 100% de certeza diagnóstica (WHO, 2010), es por esto que, los grupos de expertos internacionales de Tropical Disease Research (TDR) / Word Health Organization (WHO) (TDR-WHO) recomiendan para tamiz, una técnica altamente sensible y para diagnóstico al menos dos pruebas en paralelo, de diferente formato. Con este diseño, el diagnóstico, puede alcanzar un rango de sensibilidad del 98-99.5%. Es decir, para obtener resultados Enfermedad de Chagas Versión No.01

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más seguros y concluyentes, se debe realizar más de una técnica diagnóstica. Sin embargo, una limitante es la presencia de resultados indeterminados (resultados discrepantes), la frecuencia de estos obedece a las características del desempeño de las pruebas utilizadas. La selección de las pruebas de diagnóstico depende de: a) la relación costo/beneficio, b) al tipo de antígenos y conjugado utilizados, ya que algunas metodologías utilizan conjugados polivalentes (Anti IgM, IgG e IgA) con el paradigma de incrementar su aplicabilidad al espectro de la enfermedad, sin embargo, puede haber un incremento de la tasa de falsos positivos. La experiencia en Sudamérica y México señala que el mejor par de técnicas utilizadas en paralelo es, un ELISA confeccionado con antígenos crudos, más otro ELISA con antígenos recombinantes. Las técnicas de biología molecular han mostrado una variabilidad importante y a la fecha sólo son de utilidad en casos particulares. Se debe tener en cuenta que los valores predictivos, positivos o negativos, varían en función de la prevalencia regional de la infección. El 64% de los laboratorios de la RNLSP utiliza antígenos recombinantes (Formato: ELISA 50%, Aglutinación de partículas de gelatina (APG) 37.5% y prueba en mancha 12.5%), el 96% antígenos crudos (Formato: ELISA 68% y HAI 78.6) y el 7.0 % parasito integro (Formato: IFI). El equipo requerido para realizar éstas técnicas depende del formato seleccionado, en general se requiere de un lector de ELISA para placas completas con un filtro de 450 nm y otro de referencia entre 600-650 nm, un lavador para placas completas, un microscopio de fluorescencia, una incubadora, baño María (28-37°C) y micropipetas multicanales y sencillas con volúmenes variables, además de todo el material requerido especificado en el inserto del producto comercial, pero no incluido en los estuches de diagnóstico. Los procedimientos se deben realizar siguiendo las indicaciones del inserto que se encuentra dentro del estuche de diagnostico para dar cumplimiento con la validación de cada serie de muestras y sesión de trabajo. Cabe señalar que en el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas, no existe ni una técnica, ni un suero de referencia nacional o internacional. El algoritmo de referencia del InDRE para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, se deriva de la modelación como árbol de decisión, en donde las muestras ingresadas tienen una probabilidad a priori de ser reactivas o no, y depende del servicio solicitado es decir, en una muestra referida para control de calidad se espera mayor certeza diagnóstica, ya Enfermedad de Chagas Versión No.01

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que la probabilidad a priori de ser reactiva es mayor que en una muestra que es referida para diagnostico o referencia y es bajo esa condición que se desarrollo el algoritmo. Para lo cual fue necesario considerar los métodos a utilizar, el orden de realización (paralelo/serie), el momento de la toma de muestra y la interpretación apropiada de los resultados. Los métodos actualmente validados son: ELISA, Hemaglutinación indirecta (HAI) e Inmunofluorescencia (IFI). No existen actualmente otras pruebas validadas para diagnóstico de infección chagásica. Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son: Sensibilidad (S), Especificidad (E) y Valor predictivo (VP). Estos últimos dependen de la prevalencia de la infección. Los laboratorios de la RNLSP deben tener disponibles al menos dos pruebas de formato diferente. Estas pruebas son seleccionadas de acuerdo a la complejidad del laboratorio, su infraestructura y la formación profesional de su personal operativo. La ejecución de dos pruebas inmunoserológicas no garantiza un resultado definitivo, ya que se pueden presentar algunas situaciones que es necesario conocer y resolver. El valor umbral, valor crítico o valor de corte, es el punto C en la escala de medición (densidad óptica ó razón S/Co; en donde S es la densidad óptica de la muestra estudiada y Co es el valor de corte) que clasifica la muestra como positiva o negativa, este valor da un sentido simple y práctico para interpretar el resultado: el valor Yi etiqueta al individuo como libre de la enfermedad si Yi < C ó con la enfermedad si Yi > C. Sin embargo, esta regla de decisión presenta una región de incertidumbre o zona gris, en la que los valores no determinan si es positivo o no y se reportan como no concluyente (resultado indeterminado). La zona de incertidumbre se determina en absorbancia como C ± 10%, y de 0.9 a 1.1 para la razón S/Co. Estos valores están descritos en el inserto del equipo de diagnóstico utilizado. Un ejemplo de situaciones especiales sería:

Tabla 3 Algoritmo de dos pruebas, interpretación en paralelo, resultados esperados y su interpretación.

METODO ELISA IFI

+ +

-

Interpretación:

Reactivo

No Reactivo

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RESULTADO + -

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Discordante

+ Discordante Página 20 de 48 OCTUBRE 2012

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a. Situación: caso discordante: Decisión en el laboratorio:  Repetir la prueba con la misma muestra.  Referir a referencia, LESP o InDRE.  Solicitar una nueva muestra, en aproximadamente mes y medio. Decisión del médico  No considerar como infectado.  Explicar al paciente que las pruebas de laboratorio tienen limitaciones y hay que valorar con base a la clínica y la epidemiologia. b. Situación: caso no concluyente (indeterminado, zona gris): Los valores de densidad óptica se sitúan muy cerca del punto de corte (±10%), el resultado no debe considerares positivo o negativo, se debe reportar como indeterminado. Decisión en el laboratorio:  Repetir la prueba con la misma muestra.  Referir a referencia, LESP o InDRE.  Solicitar nueva muestra, en aproximadamente tres semanas. Decisión del médico:  No considerar como positivo o negativo.  Explicar al paciente que las pruebas de laboratorio tienen limitaciones analíticas.

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Figura 3. Algoritmo Inmunodiagnóstico

2. DIAGNÓSTICO PARASITOLOGICO

El Laboratorio juega un papel determinante en el diagnóstico

de la Enfermedad de

Chagas sin embargo, este diagnóstico debe ser integral y por ello también, se deben evaluar los datos clínicos, y epidemiológicos de la infección.

Existen tres aspectos

fundamentales deben ser considerados al realizar un análisis: ¿Cuándo realizarlo?, ¿Qué tipo de análisis se debe realizar? y ¿Cuáles son los objetivos del análisis? La demostración de la presencia del parásito, T. cruzi, es el diagnóstico indiscutible de infección chagásica pero solo se recomienda practicarlo, en la etapa aguda de la enfermedad es decir, entre los 7 a 15 días de manifestaciones clínicas ya que en las etapas indeterminada y crónica de la enfermedad la sensibilidad puede ser menor al 50%. Como en otras enfermedades infecciosas, se presenta un periodo de ventana que es imprescindible conocer para evitar la utilización de métodos de diagnóstico en momentos inadecuados y obtener resultados falsos positivos. Al término del periodo de ventana comienza la fase aguda en donde las pruebas diagnósticas parasitológicas pueden Enfermedad de Chagas Versión No.01

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alcanzar una sensibilidad superior al 95%. Conforme progresa la infección (después del día 15), la sensibilidad de las pruebas diagnósticas decae hasta el 50%. Los métodos de elección para la detección del parásito durante la fase aguda son aquellos que requieren procesos de al menos 3 horas. El xenodiagnóstico, el hemocultivo y la utilización de animales de experimentación solo se recomiendan para confirmar la presencia del parásito en las fases indeterminada y crónica. En la siguiente tabla se presentan ventajas y desventaja de las diferentes técnicas de diagnóstico:

Tabla 4. Ventajas y desventajas de las técnicas de diagnóstico, parasitológico de la Enfermedad de Chagas

Técnica Frotis, Gota gruesa

Microhematocrito fluorescente

Hemocultivo

Inoculación en ratón

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Ventajas 1. 2. 3. 4.

Resultado temprano Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo 1. Elevada sensibilidad 2. Certeza diagnóstica 3. Facilidad en la obtención de la muestra 4. Bajo costo 5. Elevada sensibilidad 6. Certeza diagnóstica 7. Facilidad en la obtención de la muestra 8. Bajo costo

11. Elevada sensibilidad 12. Certeza diagnóstica 13. Facilidad en la obtención de la muestra 14. Se incrementa costo

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Desventajas Sensibilidad cercana al 60% en el período agudo y 10% en el período crónico.

Sensibilidad de 90% a 100% en el período agudo, no valorada en crónico. 9. Sensibilidad de 90% a 100% en el período agudo, en crónico 2050%. 10. Requiere experiencia del operador. Contaminaciones por hongos o bacterias. 15. Sensibilidad de 90% a 100% en el período agudo, en crónico 2050%. 16. Requiere experiencia del operador. 17. Infraestructura compleja como por ejemplo un bioterio, gabinetes de bioseguridad, etc..

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Los

métodos

parasitológicos

convencionales

permiten

detectar

al

parásito,

y

consecuentemente efectuar el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los casos durante el período agudo. Figura 4. Algoritmo diagnóstico parasitológico fase aguda

1. Frotis sanguíneo (CLAVE: 1D2612002: Identificación morfológica del agente en muestras de sangre) Esta técnica se utiliza también para detectar otros protozoarios hemáticos. En el caso de T. cruzi se observan los tripomastigotes como estructuras alargadas en forma de "S" o "C" entre los eritrocitos. Los frotes deben de ser lo suficientemente delgados para poder leer un texto a través de la extensión. Los portaobjetos deben estar limpios y desgrasados.

a. Material y equipo Enfermedad de Chagas Versión No.01

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 Alcohol metílico grado reactivo  Colorante de Giemsa  Lancetas  Microscopio  Portaobjetos  Solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2  Torundas de algodón humedecidas en alcohol etílico al 70%.  Torundas de algodón secas

b. Procedimiento

1.

Realizar la punción digital.

2.

Desechar la primera gota de sangre y limpiar con una torunda de algodón seca.

3.

Obtener una segunda gota de sangre y colocarla sobre la mitad de una de las caras de un portaobjetos desengrasado.

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4.

Colocar frente a la gota un portaobjetos auxiliar en un ángulo de 45°, sujetarla por sus bordes mayores.

5.

Proceder a extender la muestra con un movimiento uniforme hacia el extremo libre del portaobjeto, hasta terminar el extendido.

6.

Dejar la preparación sobre una superficie horizontal hasta que se seque (protegerla de polvo, moscas y otros insectos).

7.

Identificar el extendido escribiendo con lápiz sobre la sangre el nombre, edad y sexo del paciente. El frote siempre se deberá fijar con alcohol metílico antes de enviar.

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8.

Para fijar el extendido, introducir la parte correspondiente al frote en un recipiente de boca ancha conteniendo alcohol metílico sin diluir, escurrir el alcohol excedente, sin que se moje la gota gruesa.

9.

Colocar el portaobjeto sobre una superficie horizontal hasta que seque.

10. Teñir con Giemsa como se indica en el procedimiento de tinción de la gota gruesa.

Puntos críticos Realizar el extendido de manera uniforme. Evitar que se moje la gota gruesa con el alcohol metílico. Usar portaobjetos limpios y desengrasados.

2. Gota gruesa (CLAVE: 1D2612002: Identificación morfológica del agente en muestras de sangre) Es un método de concentración para buscar parásitos sanguíneos y tiene mayor sensibilidad que el examen directo y el frote. Es indispensable hemolizar la muestra sanguínea para que los eritrocitos acumulados no impidan la observación de los parásitos.

a. Reactivos, material y equipo 

Lancetas estériles desechables



Microscopio



Portaobjetos



Torundas de algodón con alcohol etílico al 70 %

b. Procedimiento 1. Obtener otra gota de sangre de la misma punción de donde se obtuvo la anterior, para el frote sanguíneo (punto anterior).

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2. Obtener la muestra del dedo apretándolo suavemente por sus bordes laterales hacia su extremo. 3. Sobre la misma cara del portaobjetos donde se hizo el extendido sólo que en la parte media libre, colocar otra gota de sangre más grande que la anterior. 4. Con el ángulo de un portaobjeto auxiliar y con movimientos circulares se extiende la gota en un cuadro de más o menos 2 cm por lado. 5. Dejar la preparación sobre una superficie horizontal hasta que se seque, abanicar con la mano para obtener un secado más rápido (protegerla del polvo, moscas y otros insectos).

Punto crítico La gota gruesa no se debe poner en contacto con alcohol metílico por lo que se debe cuidar de no introducir la porción del portaobjetos con la gota gruesa en el alcohol, ni dejar que escurra el fijador sobre de ella.

Tinción Preparar la solución de trabajo del colorante Giemsa con solución amortiguadora de fosfatos realizando una dilución 1:10 de la solución madre.

1. Cubrir las láminas con la solución de trabajo y dejar teñir durante 30 minutos. 2. Transcurrido el tiempo de tinción lavar el frote con agua de la llave. 3. Colocar sobre una superficie horizontal hasta que se seque.

Punto crítico El tiempo de tinción debe de estandarizarse cada vez que se prepara colorante.

Lectura 1. Enfocar primero la gota gruesa, utilizando los objetivos de menor a mayor aumento. 2. Cubrir con aceite de inmersión ambas muestra teñidas, hasta conseguir una imagen nítida con el objetivo de inmersión. 3. Emplear filtro azul. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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4. Buscar sistemáticamente la presencia del parásito en todo el portaobjeto hasta asegurarse de dar un resultado final correcto. 5. Observar todos los campos microscópicos de ambas muestras antes de emitir un resultado negativo.

3. Microhematocrito fluorescente (QBC)* (CLAVE: 1D2612001: Identificación rápida en sangre (microhematocrito fluorescente)

El sistema de microhematocrito fluorescente (QBC) es un método de diagnóstico cualitativo de alta sensibilidad para detectar rápidamente la presencia de parásitos hemáticos como plasmodios, tripanosomas y microfilarias en sangre capilar o venosa, centrifugada. La capa de leucocitos y plaquetas que se forma en los tubos capilares con sangre, al ser centrifugados, se expande en una capa delgada alrededor del flotador cilíndrico de alta precisión introducido en el tubo capilar, formando tres estratos celulares. El sistema utiliza anaranjado de acridina para teñir las nucleoproteínas celulares, y la fluorescencia de los componentes incrementa su visibilidad. Se observan en la parte superior (hacia el plasma) las plaquetas anaranjado-amarillentas, en la capa media los linfocitos y monocitos de tono verde y en la capa inferior se localizan los granulocitos amarillos y debajo de los granulocitos, se encuentra el paquete de glóbulos rojos. Los tripomastigotes sanguíneos del T. cruzi se ubican en la inter fase de plaquetas y plasma, se observan teñidos de color verde tenue en su citoplasma, pero de un tono verde fuerte el núcleo y el cinetoplasto.

a.

Equipo

Equipo de Microhematocrito fluorescente (QBC) de Becton Dickinson

b.

Procedimiento

1. Llenar el tubo capilar por el extremo más cercano a las dos líneas azules, con sangre capilar o venosa, hasta las marcas azules. 2. Girar el tubo entre los dedos índice y pulgar para mezclar con el anticoagulante. 3. Inclinar el tubo hacia el extremo libre y girar para mezclar con el naranja de acridina. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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4. Colocar el tapón en el extremo más alejado a las líneas azules. 5. Introducir el flotador con las pinzas. 6. Identificar el tubo con su clave correspondiente, colocando la etiqueta entre las líneas blancas. 7. Centrifugar durante 5 minutos a 14000 rpm. 8. Colocar los tubos en una gradilla con el tapón hacia abajo. 9. Se pueden conservar hasta tres días a temperaturas de entre 16°C a 37 °C. 10. Colocar el capilar en el porta tubo y este a su vez en la platina del microscopio. 11. Agregar una o dos gotas de aceite de inmersión sobre el tubo capilar. 12. Enfocar la capa de leucocitos con el objetivo especial. 13. Buscar las formas parasitarias en la interface correspondiente.

Puntos críticos La lectura debe ser inmediatamente después de la centrifugación, de lo contrario se puede producir lisis del tripomastigote.

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Figura 5. Algoritmo diagnóstico parasitológico fase crónica.

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4. Hemocultivo [CLAVE: 1D2612004: Aislamiento a partir de muestras de sangre (cultivo)] Es un método de diagnóstico parasitológico que permite la reproducción del parásito. La sensibilidad en los casos agudos es cercana al 100%, pero en las fases indeterminada y crónica puede disminuir hasta el 50%.

a. Reactivos, material y equipo  Caldo infusión cerebro corazón estéril  Centrífuga clínica  Gradillas para tubos de ensaye  Heparina  Incubadora (28ºC)  Jeringas estériles desechables de 20 mL con aguja  Microscopio  Pipetas Pasteur  Portaobjetos y cubreobjetos  Tubos de ensayo con medio de Warren

b. Procedimiento 1. Utilizar medio de cultivo de Warren en condiciones de esterilidad. 2. Extraer 10-20 mL de sangre por punción venosa en un tubo con heparina. 3. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos. 4. Separar el plasma en otro tubo y por separado tomar el paquete de leucocitos. 5. Mezclar el paquete de leucocitos con 10 mL de caldo infusión cerebro corazón. 6. Sembrar 2.0 mL de la suspensión celular anterior en medio de cultivo de Warren en cinco tubos diferentes. 7. Cerrar perfectamente los tubos sembrados e identificar con claridad cada uno de ellos. 8. Agitar suavemente cada tubo inclinándolo 90 º (no provocar burbujas). 9. Incubar los tubos sembrados a 28°C durante 8 días. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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10. Para la revisión de los cultivos, extraer con ayuda de una pipeta Pasteur estéril una gota del medio de cultivo que se coloca entre portaobjetos y cubreobjetos para observar al microscopio con objetivo de 40x. 11. Revisar al microscopio cada tubo de cultivo y hacer resiembra por duplicado, se continúa cultivando y se revisan los tubos cada 15 días por un periodo de 3 meses. 12. Descartar los tubos que continúen negativos después de este tiempo. Esterilizar y lavar.

Interpretación Se da como positivo el hemocultivo cuando se detectan las formas móviles características del flagelado en su fase de epimastigote en las preparaciones de los medios de cultivo sembrados.

Puntos críticos Evitar la dispersión del paquete leucoplaquetario después de la centrifugación. No retirar en su totalidad el plasma, dejar de 2 a 3 mm del plasma, por arriba del paquete.

Preparación del Medio de Warren. Materiales 

Agar nutritivo al 2.8%, estéril.



Caldo de infusión cerebro corazón (BHI) según instrucciones del fabricante,



Sangre desfibrinada de conejo, estéril.



Suero fetal de ternera (SFT), descomplementado.



Gentamicina 200X.

Preparación 5. Esterilizar los medios de cultivo, agar nutritivo y BHI, a 15 Lb de presión durante 15 minutos en autoclave. 6. Mantenga la temperatura del agar nutritivo a 45 °C y agregue sangre de conejo, 5% v/v. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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7. Envasar 3.0 mL de medio en tubos de ensaye para cultivo con tapón de rosca de 16x150, estériles. 8. Colocar los tubos a una inclinación de 10° hasta que se solidifique el agar. 9. Hacer pruebas de esterilidad a 28°C por 24 horas. 10. Complementar el caldo de infusión cerebro corazón, al 1%, con suero fetal de ternera al momento de hacer la siembra del medio de cultivo. Adicionar gentamicina a una concentración final de 5 µg/mL de BHI.

5. Modelo experimental (CLAVE: 1D2612005: Aislamiento a partir de muestras de sangre [inoculación en ratón)] Los animales más utilizados son los ratones Balb/c jóvenes (seis semanas de vida). Antes de inocular a los ratones es importante estar seguros que no están infectados con Trypanosoma lewisi, por tinción en sangre del ratón y observación al microscopio Se recomienda utilizar un lote de seis ratones por paciente.

a. Reactivos, material y equipo 

Colorantes de Giemsa



Jeringa desechable estéril de 5mL con aguja



Microscopio



Portaobjetos y cubreobjetos



Solución salina isotónica



Tijeras



Tubo o frasco estéril con heparina



Torundas de algodón con alcohol yodado



Jeringas de insulina

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b. Procedimiento 1. Obtener una muestra de sangre del paciente por punción venosa previa asepsia del área de la toma de muestra, con alcohol yodado. No retirar el capuchón de protección de la aguja hasta el momento de realizar la punción. 2. Cerca de un mechero o lámpara de alcohol depositar la sangre en un tubo o frasco estéril que contenga anticoagulante (heparina, es el producto de elección). 3. Inocular a los animales inmediatamente después de tomar la muestra, con 0.2 mL a 0.3 mL de sangre por vía intraperitoneal a cada animal. Si la muestra no se puede procesar de inmediato, conservar la muestra de sangre en refrigeración hasta su procesamiento. El tiempo de almacenaje puede ser hasta de 48 horas. 4. Mantener los animales inoculados con agua y alimento a libre demanda en condiciones de bioterio, es decir temperatura y humedad controladas entre otras. 5. Ocho días después de la inoculación, practicar un corte en la porción distal de la cola del ratón. 6. Realizar un examen directo, que consiste en la observación al microscopio entre porta y cubre buscando al parásito por el movimiento de este y en otro portaobjetos hacer un frotis y gota gruesa. 7. A los 15 días después de la inoculación practicar un nuevo corte en la porción distal de la cola del mismo ratón. 8. Realizar un examen directo de la sangre y en otro portaobjetos hacer un frotis y gota gruesa.

Nota: Si se muere el ratón extraer en condiciones estériles la sangre por punción cardiaca para inocular otro ratón; obtener corazón, diafragma, intestino, esófago e hígado, lavarlos con solución salina estéril. Tomar improntas, seccionar y hacer cultivo de cada órgano en medio de Warren.

Puntos críticos Asegurarse de inocular en cavidad peritoneal. Saber manejar animales de laboratorio. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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INFECCION CONGÉNITA O CONNATAL. El diagnostico de infección congénita se realiza por métodos parasitológicos a partir del nacimiento y durante los primeros meses de vida, y por métodos inmunoserológicos, a partir de los 9-12 meses (Consenso de Cochabamba). La observación del parásito confirma el diagnóstico, mientras que la detección de anticuerpos es enmascarada por los anticuerpos maternos. En estos casos, aplicar el algoritmo de diagnóstico parasitológico de fase aguda, en el nivel hospitalario. Se recomienda el uso de microhematrocrito o micro Strout. Es necesario recurrir a las curvas serológicas, que presentan la cinética de los niveles de IgG sérica. Existen dos comportamientos de las curvas serológicas, a) si el niño nace infectado, mantendrá o incrementará los niveles de anticuerpos durante el primer año de vida, b) si la positividad se deba a la presencia de anticuerpos maternos el catabolismo elimina la IgG materna y los títulos de anticuerpos caerán hasta la negatividad entre los 6 y 12 meses de vida. Las muestras enviadas al InDRE para este fin, deben ser claramente identificadas.

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Figura 6. Cinética de anticuerpos de la clase IgG en hijo infectado de madre chagásica desde el nacimiento y por trimestre durante el primer año de vida.

Cinética de IgG TITULO DE Ac

1000 100 10 1 0

3

6

9

12

TIEMPO (meses) Hijo

Madre

Tabla 5. Posibles escenarios epidemiológicos durante el primer año de vida del hijo de madre chagásica

Grupo 1

Parasitología RN * 1er año + ---------

RN +

Serología 3-6 m 9-12 m + +

2

-

+

+

+

+

3

-

-

+

+

+

4

-

-

+

±

-

Interpretación diagnóstica Infección congénita Infección de origen no confirmado* (Vectorial, transfusional, digestiva) Infección de origen no confirmado* Ausencia de infección

* El diagnóstico parasitológico se puede realizarse en el momento del nacimiento, o durante el primer año de vida. Para confirmar infección congénita debe detectarse el parásito y descartar cualquier otra posible vía de infección.

Es importante considerar que la experiencia sudamericana recomienda, que cualquiera haya sido la vía de infección, el tratamiento es efectivo mientras más temprano se administre; en nuestra experiencia, se recomienda administrarlo antes de los tres años de vida, por lo cual resulta importante realizar el diagnóstico lo más precozmente posible. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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SEGUIMIENTO DE TRATAMIENTO

El tratamiento etiológico en la enfermedad de Chagas está dirigido a eliminar el parásito del organismo del hospedero y evitar la aparición y/o progresión de lesiones. Las indicaciones para el tratamiento etiológico en la enfermedad de Chagas, propuestas por la OMS y el consenso de la comunidad científica son para: todos los casos agudos, inclusive los congénitos; individuos en quimioprofilaxia (accidentes, trasplantes);

episodios de

reactivación;crónicos de baja edad y crónicos recientes y formas clínicas iniciales (en carácter experimental). Aunque la eficacia del tratamiento etiológico contra la infección por T. cruzi

ha sido

demostrada, las herramientas para su evaluación son todavía de implementación e interpretación complejas. Un tema importante que aun presenta controversias es la definición de cura de pacientes que recibieron tratamiento etiológico. Hasta ahora, el criterio universalmente aceptado es el obtenido por la conversión negativa de la serología convencional. Sin embargo, las técnicas serológicas disponibles fueron diseñadas para el diagnostico y no para evaluar la eficacia del tratamiento, ya que presentan diferentes respuestas según el antígeno o mezcla de antígenos empleados, y el diseño de prueba serológica a usar. El seguimiento serológico es prolongado y los resultados obtenidos son en gran parte controversiales. Como criterios de evaluación del tratamiento (criterios de cura), se investigan los cambios en la serología, la parasitemia y la evolución clínica; mientras los primeros se pueden observar en meses, la evaluación clínica requiere años de control. Otro inconveniente es en aquellos pacientes en quienes la enfermedad ha evolucionado por lo menos 20 años y la evidencia de seroconversión sólo puedo observarse muchos años más tarde. Hecho que ha desalentado a diversos grupos de investigadores. En la actualidad, se recomienda utilizar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para evaluar la eficacia pos-tratamientosin embargo, esta prueba tiene un alto costo, requiere un laboratorio con alta tecnología y personal calificado, pero sobretodo se requieren más estudios para su correcta aplicación. Las muestras remitidas al InDRE para seguimiento de tratamiento deben estar bien etiquetadas de acuerdo a criterios de aceptación y rechazo de muestras InDRE, las muestras de seguimiento deben ser enviadas con justificación referencia, el volumen mínimo de la muestra debe ser de al menos 1.0 mL. Enfermedad de Chagas Versión No.01

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ESTÁNDARES DE CALIDAD El tiempo máximo para el reporte de resultados hasta finalizar con el algoritmo depende del tipo de análisis solicitado. Para serología, el estándar de diagnóstico es de 10 días hábiles, para control de calidad y referencia es de 15 días hábiles. Para diagnóstico parasitoscópico: Frotis/Gota gruesa / hematocrito fluorescente tres horas caso agudo. Hemocultivo e inoculación en ratón 90 días hábiles. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO

1. La muestra de sangre total para el aislamiento, frotis, gota gruesa o microhematocrito fluorescente, en volumen apropiado, deberá acompañarse del formato F-REM-01, del resumen de historia clínica y de la solicitud del estudio. Para laminillas (Frotis o gota gruesa) el requisito es el mismo. 2. La falta de alguno de estos documentos causa rechazo, la muestra quedará en resguardo. Se notificará al usuario y contará con un periodo de siete días para enviar la documentación complementaria, de no ocurrir se rechazará definitivamente y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax. 3. La muestra no deberá estar contaminada o contener alguna sustancia interferente. Si sucede, la muestra será rechazada de manera definitiva y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax. 4. La laminilla (frotis o gota gruesa) deberá venir rotulada y no deberá estar rota, si sucede, será rechazada y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax. 5. El diagnóstico parasitológico de la tripanosomiasis americana seguirá el algoritmo. Para el aislamiento los resultados serán emitidos 90 días después de recibida la muestra, para hematocrito fluorescente, frotis y gota gruesa los resultados serán emitidos tres horas después de recibida la muestra. 6. En casos especiales, si la muestra no cumple con los criterios de calidad biológica pero el usuario considera que la muestra es de alto valor deberá notificarlo al Laboratorio de Enfermedad de Chagas por escrito en la solicitud o formato y aceptar que el resultado debe ser interpretado con cautela, quedando el laboratorio del InDRE libre de toda responsabilidad legal.

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CAPTURA DE DATOS Y RESULTADSOS La captura de los datos en la plataforma Info-Lab InDRE se realizará de acuerdo a la capacitación recibida por el departamento de recepción de muestras. PROGRAMA DE EVALUACION EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) SEROCHAGAS El Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) genera información de orden nacional, integrando y siendo rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, en materia de diagnóstico, investigación y desarrollo tecnológico para la vigilancia epidemiológica, para la toma de decisiones en el control de enfermedades y la formulación y orientación de los programas nacionales de salud. En este sentido en el Instituto, uno de nuestros compromisos es que el InDRE y la RNLSP generen información confiable y oportuna para la toma de decisiones en apoyo de la vigilancia epidemiológica y los Programas Nacionales de Salud, en apego a la normativa vigente y las buenas prácticas de laboratorio. En el 2001, el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas fue incorporado al marco analítico básico de los Laboratorios Estatales de Salud Pública, quienes en agosto de 2008 ratificaron la importancia de fortalecer su aplicación en todo el país. Dos meses después, en octubre de 2008, se inició el Programa de Evaluación Externa del Desempeño del Diagnóstico Serológico de la Enfermedad de Chagas para los laboratorios de apoyo a la salud pública en México, con la participación de los LESP que incluyeron la(s) prueba(s) en el marco analítico estatal registrado en el InDRE y/o participaron en las actividades de control de calidad del InDRE así como de laboratorios universitarios y de centros de investigación que realizan el diagnóstico serológico o desarrollan nuevos antígenos para el mismo fin. Con esta base, el Programa de evaluación externa del desempeño (PEED) para serología de Chagas se suma al esfuerzo institucional de evaluar el desempeño de los laboratorios de la RNLSP y contribuir al mejoramiento del serodiagnóstico de este padecimiento. ENVÍO DE PANELES DE EFICIENCIA El laboratorio de Chagas del InDRE es el organizador de PEED_SEROCHAGAS y se encarga de: Enfermedad de Chagas Versión No.01

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Producir el panel de sueros con respaldo documentado de las características de reactividad de cada muestra,



Embalar el panel en condiciones óptimas para el envío a los laboratorios participantes, incluyendo instrucciones detalladas para el manejo del mismo.



Elaborar los reportes de resultados y enviarlos a los participantes.



Mantener la confidencialidad de los laboratorios participantes mediante una clave única.

Se envía un panel de sueros obtenidos de plasma por procedimientos estandarizados, utilizados por expertos colaboradores de la OMS.. Contiene muestras con positividad para el marcador de enfermedad de Chagas y negativas para todos los marcadores virales utilizados en el tamizaje en banco de sangre. Se trata de un panel de 12 sueros, caracterizados con todas las pruebas de algoritmo diagnóstico del InDRE (HAI, IFI, ELISA, WB) y los estuches comerciales disponibles actualmente en el mercado nacional. El envío de un primer panel será la segunda semana de marzo del año en curso, y el segundo envío será en segunda semana de septiembre del año en curso. CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS

Los resultados deberán ser registrados en el formato CHAG-F-21, el cual se encuentra en la hoja electrónica del InDRE, Parasitología

en la sección correspondiente al Departamento de

(http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/dpto_parasitologia.html).

Se recomienda descargarlo en formato de Excel, no guardarlo como imagen, para facilitar su llenado y leer cuidadosamente el instructivo de llenado que se encuentra en el mismo archivo. Una vez completado el formato en Excel deberá ser enviado vía electrónica a [email protected]

y

[email protected], en

la fecha

y hora

acordadas. El formato impreso y firmado en original, deberá ser enviado por oficio a la Dirección General Adjunta del InDRE con atención al Director General:

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INFORME DE RESULTADOS PEED SEROCHAGAS A RNLSP Los resultados serán expresados en resultados concordantes, resultados falsos positivos y falsos negativos los cuales se presentarán en cuadros y gráficos, con las cifras globales e individuales. Se realizará un informe preliminar con los resultados de concordancia por participante será enviado a cada participante cuatro semanas después de la entrega de resultados a InDRE. El objetivo de este informe preliminar es recibir comentarios y aclaraciones por parte de los laboratorios participantes de la RNLESP El informe final detallado se envía cuatro semanas después el envío del informe preliminar. CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO Adquiere la liberación diagnóstica el LESP si cumple: 1. Tener establecido un algoritmo de diagnóstico (par serológico), con un diseño en paralelo, con pruebas de alto desempeño, una debe utilizar antígenos totales como fuente de antígeno y la otra antígenos recombinantes. 2. Participar en el PEED SEROCHAGAS por tres ciclos seguidos con una calificación ≥ 95%. 3. Tener concordancia (C) en el VCE ≥ 90%. 4. Participar en el Curso-Taller anual 5. Tener una calificación (C+PEED)/2 ≥ 95 %.

Mantiene su liberación diagnostica el LESP si cumple: 1. Todo lo anterior 2. Envío del 90% de muestras positivas de acuerdo a: (No de muestras recibidas InDRE / No de muestras reportada en SIS) x 100 3. Envío del 10% de muestras negativas de acuerdo a: (No de muestras recibidas InDRE / No de muestras reportada en SIS) x 100

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Pierden su liberación diagnóstica el LESP si no cumple: 1. Alguno punto de lo señalado anteriormente. 2. Si el LESP requiere confirmar su desempeño técnico, debe solicitar un nuevo panel, cuyo costo es de acuerdo al tabulador vigente. El panel deberá ser solicitado dentro de los siguientes 10 días hábiles, después de haber recibido el informe final. Cabe mencionar que la calificación obtenida en este panel no será tomada en cuenta para el Boletín Caminando a la Excelencia. 3. Concordancias no aceptables (<95%) en el segundo panel, requerirán de capacitación y de establecer nuevamente el envío de muestras para realizar diagnóstico en el InDRE. BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO El objetivo de banco es obtener material de control y referencia con una calidad adecuada que permita calibrar reactivos diagnósticos de elaboración propia, evaluar el desempeño de equipos de diagnóstico comerciales y ser utilizado en protocolos de investigación. Características de la muestra       

La muestra debe se de al menos 1.0 mL. La muestra debe ser fresca, si no es así asegurarse que ha sido conservada adecuadamente, de preferencia congelada a –20 ºC. No lipémica. No hemolizada, No contaminada. Si cumple lo anterior es fraccionada, etiqueta y congela a –60 ºC hasta su uso. El material ingresado al banco se registra en una bitácora de control y seguimiento.

Respaldo documental En Archivo del Banco de Sueros debe existir la historia clínica o formato único de envió de muestras al InDRE y registro de los resultados del LESP como del InDRE.

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

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BIBLIOGRAFIA 1. Chagas Congénito: Estrategias de diagnóstico y Control. 2007. 2da. Edición. Cochabamba – Bolivia 2. Fierz, W.2004. Basic Problems of Serological Laboratory Diagnosis in: Methods in Molecular Medicine, vol. 94: Molecular Diagnosis of Infectious Diseases, 2/e Edited by: Decker, J and Reischl. U. Humana PressInc.,Totowa, NJ. 3. Guzmán Bracho C, Floriani Verdugo J, Pastén Sánchez S y col. 2000. Manual de procedimientos para laboratorios de diagnóstico de enfermedad de Chagas o tripanosomosis americana. Secretaria de Salud. InDRE, México. 4. Guzmán Bracho C. 2001. Epidemiology of Chagas disease in Mexicoanupdate. TRENDS in Parasitology. 17(8)372-376. 5. Luquetti AO, Rassi A 2002. Conferencia: Perspectiva del uso de la serología (Ag naturales y otros) en la evaluación de la eficacia del tratamiento etiológico. Available from URL: http://www.fac.org.ar/fec/chagas2/llave/c003/luque.htm. 6. Luquetti AO. 2007. Diagnóstico de la enfermedad de Chagas: Diagnóstico serológico, xenodiagnóstico, hemocultivo, reacción en cadena de la polimerasa y examen directo. En: Enfermedad de Chagas. Sociedad Colombiana de Cardiología y Cirugía Cardiovascular. 1ª Ed.Pág. 25-31. 7. Luquetti AO., Rassi A.2007. Tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas. Experiencia en Brasil. En: Enfermedad de Chagas. Sociedad Colombiana de Cardiología y Cirugía Cardiovascular. 1ª Edición, Pág. 145-148. 8. NOM-032-SSA2-2010, para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por vector. 9. PasténSanchéz S. 2003. Manual de Técnicas de Laboratorio. Laboratorio de Enfermedad de Chagas. InDRE, México. 10. Secretaria de vigilânciaemsaúde do ministério da saúde:Consenso brasileiro emdoença de chagas. 2005. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical Vol. 38 (Sup. III). 1-30. 11. WHO. 2000. Control of Chagas Disease: second report of the WHO expert committee. Geneva. 12. WHO. 2003. Manual of basic techniques for a health laboratory. 2nd ed. Geneva. 13. WHO. 2005. Reporte del grupo de trabajo científico sobre la enfermedad de Chagas. TDR/GTC/06. Geneva.

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14. WHO.2007. Consultation on International Biological Reference Preparations for Chagas Diagnostic Test. Switzerland. 15. WHO.2010. Anti-trypanosoma cruzi assays: operational characteristics. Diagnostics and Laboratory Technology. Geneva. 16. WHO. 1991. Control of Chagas Disease. Report of a WHO Expert Committee. WHO Tech. Rep. Ser. 811. 17. Schmunis G.A. 1999. Iniciativa del Cono Sur. Proceedings of the second International Workshop on Population Genetics and Control of Triatominae. Tegucigalpa, Honduras. INDRE, México City. Pp.26-31. 18. Hoffman C. 1928. Nota acerca de un probable transmisor de la tripanosomiasis humana en el Estado de Veracruz. Rev Mex Biol 8,12-18 19. Mazzotti L. 1940. Dos casos humanos de enfermedad de Chagas en el estado de Oaxaca. Gac. Méd. Mex (Méx). 70, 417-420. 20. Pinto Dias JC. 1992. Epidemiology of Chagas' disease In: Chagas' disease (American Trypanosomiasis): Its impact on transfusion and clinical medicine. Wendel S, Brener Z, Camargo ME, Rassi A (editors). ISBT Brazil'92, Sao Paulo, Brazil. pp 49-80.

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Anexo I: CARACTERISTICAS DE EQUIPOS COMERCIALES

EQUIPOS DISPONIBLES EN MEXICO

ESPECIFICACIONES TECNICAS RENGLÓN o PARTIDA CONCEPTO No.

1

2

DESCRIPCIÓN Y PRESENTACION DEL PRODUCTO Ensayo inmunoenzimático (EIA) para la detección de anticuerpos IgG de Trypanosoma cruzi en suero humano. Chagascreen, ELISA Método de aglutinación de particulas para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. SERODIA Chagas, APG

MARCA

Bio-Rad, S.A. México

NUMERO DE CATÁLOGO

UNIDAD DE MEDIDA

150101

Estuche para 96 pruebas

Fujirebio 227442 Diagnostics, Inc.

Estuche para 100 pruebas

3

Prueba de Hemaglutinación Indirecta para la detección de anticuerpos contra T.cruzi Chagatest HAI

Wiener Lab.

1293205

Estuche para 96 pruebas

4

Estuche para la determinación de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi. Chagatest ELISA.

Wiener Lab.

1293251

Estuche para 96 pruebas

5

Estuche para la determinación de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi. Chagatest ELISA recombinante V 3.0.

Wiener Lab.

1293254

Estuche para 96 pruebas

6

Ensayo inmunoenzimatico en mancha. ImmunoComb II Chagas Ab.

Orgenics

60481002

Estuche para 36 pruebas

7

8

9

10

11

12

13

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Ensayo inmunoenzimático en fase sólida para la detección de anticuerpos séricos dirigidos contra el Trypanosoma cruzi. TEST ELISA PARA CHAGAS III Prueba de ELISA para la detección cualitativa de anticuerpos totales de Trypanosoma Cruzi en suero o plasma humano. Bioelisa CHAGAS Estuche de Diagnóstico. Prueba de Hemoaglutinación indirecta para la determinación de anticuerpos contra el T. cruzi en muestras de suero y plasma. Chagas HAI. Estuche de diagnóstico. Prueba Microelisa para la determinación de anticuerpos contra T. cruzi, en muestras de suero y plasma. Chagas Microelisa Test System. Prueba de hemaglutinación indirecta para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. CHAGAS/HAI Estuche de diagnóstico. Prueba de ELISA Para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Enzyme-Chagas. Ensayo inmunoenzimático (EIA) para la detección de anticuerpos IgG de Trypanosoma cruzi en suero humano. Pathozyme Chagas, ELISA

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Estuche para 96 pruebas

bIOSChile

Biokit bioELISA

3000-1236

Estuche para 96 pruebas

Accutrack

ACHAI-96

Estuche para 96 pruebas

Accutrack

ACHMT-96

Estuche para 96 pruebas

Interbiol, México INB 105

Estuche para 96 pruebas

Interbiol, México INZ105

Estuche para 96 pruebas

Omega Diagnostics

Estuche para 96 pruebas

OD147

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Anexo II: PREPARACION DE REACTIVOS

Otras instituciones

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Lineamientos para la Vigilancia por Laboratorio de Enfermedad de

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DE CHAGAS InDRE – RNLSP 2012 Enfermedad de Chagas Versión No.01 InDRE - RNLSP Página ...

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