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Dehidroepiandrosterona Aspectos Psiconeuroinmunoendocrinológicos Andrea López-Mato1; Oscar Boullosa; Gonzalo Illa; Alejandra Vieitez; Patricia Willis; Coral Márquez.

Sumario: La dehidroepiandrosterona (DHEA) forma parte de un paso intermedio en el metabolismo de los esteroides sexuales adrenales. El cerebro es capaz de producir pregnenolona, y convertir a esta misma en DHEA. La DHEA, a diferencia de su forma sulfatada, posee un ritmo circadiano propio, demostrándose una disminución de su concentración plasmática vespertina. También muestra variaciones etarias con valores máximos en la adolescencia y declinación hacia la senectud, con decrecimiento paralelo de IGF-I. Sus niveles, al contrario de la forma sulfatada, son más altos en mujeres que en hombres. Tiene acciones fisiológicas sobre la función cerebral, el sistema endocrinológico, el sistema inmunitario, el sistema cardiovascular, el metabolismo, el músculo, la piel y el tejido óseo. Detallaremos su función sobre el sistema inmunológico en el cual mantiene un delicado balance con el cortisol, produciendo aumento de la actividad citoquímica Th-1. Se hará hincapié en su alteración en el stress agudo, el stress crónico y la depresión. Diversos estudios, incluído el nuestro, demuestran una alteración del ritmo circadiano (inversión o falta de ritmo) de la secreción. Se ha intentado la utilización terapéutica de DHEA en astenia, depresión, envejecimiento, trastornos de memoria, diabetes, obesidad, cáncer y enfermedades con deficiencias inmunológicas. Se analizan los "pros and cons". Palabras clave: DHEA, glucocorticoides, depresión, cognición, inmunología, eje límbico-hipotálamohipófiso-adrenal Introducción En las últimas décadas, el eje Hipotálamo-Hipófiso-Adrenal (HHA) se ha convertido en un foco de interés en diversos campos de la investigación biomédica. Son numerosos los hallazgos que vinculan este eje con la patología psiquiátrica y fundamentan estudios posteriores que avalan el rol de factores psíquicos y ambientales en su regulación. El sistema límbico (L) es, indudablemente, el nivel superior de control sobre la totalidad del eje adrenal. La psiquiatría incorporó, desde hace años, la evaluación de la función del eje L-H-H-A como herramienta de aproximación diagnóstica y pronóstica en los desórdenes afectivos. La medición basal de cortisol, su ritmo circadiano de secreción y el test de supresión con dexametasona (DST) son de gran utilidad para esta evaluación. Actualmente diversas investigaciones apuntan al estudio de productos intermedios de las cadenas metabólicas adrenales, sea su metabolismo y secreción o sus acciones sobre otros sistemas del organismo. Entre estas moléculas intermedias se encuentran la dehidroepiandrosterona (DHEA) y su forma sulfatada (DHEA-s). Ambas podrían estar involucradas en la regulación y modulación del complejo circuito psiconeuroinmunoendocrinológico. La vinculación de estos andrógenos con modificaciones en aspectos psiconeurobiológicos permitiría ampliar, a través de su estudio bioquímico, la batería diagnóstica dentro de la psiquiatría.

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DHEA y DHEA-s La dehidroepiandrosterona (DHEA), hormona derivada del colesterol, forma parte de un paso intermedio en el metabolismo de los esteroides sexuales adrenales (ver figura 1). Es el esteroide más abundantemente sintetizado, difundido y secretado en la porción cortical de las glándulas suprarrenales, tanto en humanos como en el resto de los mamíferos(38,46). Su síntesis, además de efectuarse en estas glándulas, se lleva a cabo en diversos órganos que incluyen las gónadas y el cerebro(19). A través de un proceso de sulfatación se origina la DHEA-s. Este paso metabólico, que tiene lugar en las glándulas suprarrenales, es mediado por la enzima sulfotransferasa y favorecido por acción de la ACTH. La forma sulfatada no sólo posee mayor vida media sino también mayor acción biológica. En las glándulas adrenales, tanto la DHEA como la DHEA-s se encuentran en equivalentes concentraciones, pudiendo ser secretadas en una u otra forma química(38). Ambos esteroides tienen amplia distribución tisular, demostrada a través de sofisticados métodos bioquímicos e imagenológicos que evidencian la presencia de receptores para ambas moléculas en numerosos tejidos, entre los que se destacan testículo, hígado, linfocitos, cervix uterino, cerebro y nervios periféricos. Este hecho pone de manifiesto que los esteroides forman parte de una importante pieza en el puzzle de la modulación psiconeuroinmunoendocrinológica.

La presencia de DHEA en animales adrenalectomizados y castrados llevó a buscar los otros tejidos productores de esteroides. Refiriéndonos en particular al SNC, las hormonas esteroides pueden atravesar la BHE por difusión o ser formados de novo, generalmente a partir de la pregnenolona y pocas veces directamente a partir del colesterol(22). Los primeros se denominan esteroides neuroactivos y los segundos neuroesteroides. En los primeros predominan las acciones de excitación neuronal y en los segundos las de inhibición. Esta síntesis local es efectuada por la oligodendroglia(4,22). En conclusión, el cerebro es un órgano capaz de producir ciertos esteroides a partir del colesterol, como la pregnenolona, y a su vez convertir a esta misma en DHEA. Estos esteroides de producción local en el SNC son denominados neuroesteroides, que deben ser diferenciados de aquellos esteroides periféricos con acción central o esteroides neuroactivos.

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Es conocido que los mecanismos de acción de las hormonas esteroideas pueden llevarse a cabo por dos vías diferentes en función del tipo de receptores que emplean. Estos pueden ser: Receptores citoplasmáticos o de acción genómica, los cuales ligan las moléculas esteroideas a receptores nucleares, actuando a nivel nuclear sobre los factores de transcripción y transducción de ácidos nucleicos, determinando así modificaciones en la síntesis proteica. Se caracterizan por producir sus efectos celulares a largo plazo. Receptores de membrana o de acción no genómica, los que no presentan acción específica sobre el genoma. Dada la ubicación de estos receptores sus efectos celulares están relacionados a la modificación de la conducción iónica celular. A diferencia de los anteriores, sus efectos son a corto plazo o rápidos. Esta es la vía utilizada fundamentalmente por los esteroides neuroactivos. Entre estos receptores sobresalen los siguientes: Receptor GABA-A Receptor a corticosterona Receptor a progesterona Receptor a aldosterona Receptores a estrógenos La DHEA y la DHEA-s no presentan receptores específicos conocidos al presente(6), desconociéndose el mecanismo íntimo de acción sobre otros receptores esteroideos. En el cerebro existen dos tipos de receptores esteroideos, los cuales muestran diferentes perfiles farmacológicos in vivo. Recientemente estos receptores han sido clonados e identificados como receptor a mineralocorticoides, el cual reconoce a la aldosterona y correspondería al tipo I y receptor a glucocorticoides correspondiente a los de tipo II. Ambos se encuentran ampliamente distribuidos en el hipocampo y en el núcleo paraventricular, predominando en este último los de tipo II (para glucocorticoides). Receptores de tipo I o a mineralocorticoideos (MR): poseen alta afinidad por el cortisol y la corticosterona, siendo el primero su agonista fundamental, el cual permanece ligado en forma sostenida a la mayoría de los receptores. Son activados por bajas concentraciones de cortisol, produciéndose así la inhibición del receptor. Son los responsables de la homeostasis fisiológica del tono cortisolémico. Estarían involucrados en respuestas de equilibrio ante estados de ansiedad, euforia o somnolencia. Receptores de tipo II o a glucocorticoideos (GR): éstos reconocen con mayor afinidad a la dexametasona que al cortisol. Su activación sólo responde a las concentraciones altas de cortisol, capaces de estimular estos receptores, dando como resultado una mayor inhibición del eje. En condiciones normales sólo la mitad de su número se encuentra ocupado. Estarían involucrados en situaciones suprafisiológicas o patológicas de exceso de cortisol por estados de disforia, sueño REM (en regulación de sueño intervienen también receptores a progesterona), alerta neurovegetativa, etc.

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En la depresión endógena está alterada la sensibilidad de estos receptores (down-regulation secundaria a factores genéticos o a stress crónico)(34,48), por lo cual a pesar de la hipercortisolemia que acompaña a la misma, no se logra la inhibición del eje. Esta receptorpatía se normaliza con tratamiento antidepresivo(2). El descenso transitorio de la capacidad de los receptores por acción de los antidepresivos se asocia a la restitución de la función de los receptores GR y MR, resultando probablemente en la reducción de la producción hipotalámica de CRH (factor liberador de corticotropina) y AVP (péptido arginina vasopresina)(14). En cuanto al comportamiento biológico de estas moléculas varios aspectos son de importancia para su estudio: el cronobiológico, el rango etario y el género.

Respecto de la edad, se conoce que estos esteroides muestran variaciones en función de la misma, mostrando una declinación progresiva, verificada tanto en estudios transversales(27,30,39) como longitudinales en humanos(31). Existe una síntesis muy elevada de DHEA en el feto (200 mg/día), disminuyendo su concentración a partir del nacimiento por la involución de ciertas zonas adrenales fetales(27). Posteriormente, se evidencia un pico plasmático de estos esteroides entre los 7 y 8 años de edad coincidiendo con la madurez de eje adrenal, proceso que conforma la adrenarca(10). Se ha visto que los picos plasmáticos de DHEA y DHEA-s más signiticativos ocurren en la juventud(27). La adrenarca provoca un incremento plasmático de DHEA-s, el cual precede al aumento de los esteroides gonadales en aproximadamente 2 años(27). Disminuye significativamente a partir de los 40 a 50 años, encontrándose sólo un tercio del valor hallado en el adulto joven durante la sexta década de la vida; este proceso es conocido como adrenopausia(27). Los fenómenos mencionados pueden ser relacionados tanto con la disminución anatómica de la capa reticular adrenal, como con disminuciones en la actividad enzimática de la 17-20 liasa(27). Algunos trabajos muestran declinaciones significativas en las concentraciones de DHEA plasmática no sólo con la edad sino también en relación con ciertas patologías de compromiso sistémico como ser el cáncer, la arterioesclerosis, el Alzheimer y otras(8,38). En función al decrecimiento de estos esteroides con la edad, se evalúa en la actualidad el posible rol que jugarían sobre ciertos efectos neuropsiquiátricos en la población de ancianos(45).

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Respecto de la diferencia de género, se evidencia que los niveles de DHEA-s son más bajos y los de DHEA más altos en mujeres que en hombres. Recordemos que estas moléculas son modificadas por los esteroides sexuales gonadales(27). Actualmente se conocen numerosos efectos ejercidos tanto por DHEA como por DHEA-s. Entre estos podemos mencionar el rol sobre : -el sistema endocrinológico -la función cerebral (como esteroide de acción central con función sobre el crecimiento neuronal por aumento del flujo y aumento de la producción de IGF1)(25). -el sistema inmunitario (como agente antiglucocorticoideo y en procesos de autoinmunidad)(5,33,41). -el sistema cardiovascular (prevención de enfermedad cardíaca observándose la disminución urinaria y plasmática de ambas en pacientes con IAM, hipercolesterolemia e hipertensión)(3). -el metabolismo (control lipídico por disminución de colesterol y triglicéridos, glucémico e insulínico)(28). -el músculo (glucogenólisis). -la piel (control de crecimiento piloso y secreción seborreica). -el tejido óseo (aumento de densidad ósea). El nivel plasmático de ambos esteroides varía en los distintos ciclos biológicos (adrenarca, pubertad, envejecimiento) y en algunos estados de homeostasis alterada (stress). En el cuadro 1 se detallan los valores normales plasmáticos de DHEA y DHEA-s de acuerdo al género y edad como así también los correspondientes a la secreción diaria del adulto. Estos valores se alteran sensiblemente en distintos estados patológicos (cuadro 2). El 96% va unido a albúmina y a otras proteínas y debe estar libre para actuar(11). DHEA e Inmunidad Los linfocitos CD-4 o linfocitos colaboradores o helpers (Th1 y Th2) conforman diferentes subtipos funcionales, los cuales producen y responden a diferentes patrones de interleukinas (IL), derivando así la respuesta inmune hacia la inmunidad celular (vía Th1) o la inmunidad humoral (vía Th2)(1,7,13,26).

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La DHEA es una molécula de gran interés en el campo de la inmunología actual, dado que participa en íntimos procesos de regulación del sistema inmunológico. Gracias a la identificación de receptores para DHEA en los linfocitos Th, dicho esteroide fue motivo de numerosas investigaciones en este campo con llamativos hallazgos que a continuación se mencionan: Importancia en la diferenciación de los subtipos de linfocitos Th (Th1 y Th2) desviando el balance Th1 / Th2 hacia la inmunidad de tipo celular(7,9,23,24). Esta acción sobre los Th invita a hipotetizar que la DHEA proporcionaría una mayor respuesta inmunológica en pacientes inmunodeprimidos(29,36). Estimula, a través de los Th, la producción de IL-2, aumentando sus concetraciones(36). La disminución de DHEA (ej: edad) provoca un incremento en las concentraciones de la IL-6, en forma inversamente proporcional(36). Llamativamente, la DHEA provocaría incremento en las concentraciones de aquellas citoquinas inmunológicas que se encuentran mayoritariamente alteradas en los desórdenes afectivos. Por otra parte, los glucocorticoides junto a la DHEA muestran un delicado balance inmunológico, puesto de manifiesto por la relación DHEA/cortisol. En función de esto, sabemos que la secreción de glucocorticoides se asocia a un incremento de la actividad Th-2 mientras que la liberación de andrógenos y la DHEA aumenta la actividad Th-1 (ver figura 2). Por lo tanto la actividad del eje límbico-hipotálamo-hipófiso-adrenal, a través del cociente Cortisol/DHEA, podría sugerirse como indicador del balance de citoquinas Th-1 / Th-2.

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En función con lo mencionado anteriormente ciertas líneas de investigación sugieren colocar a la DHEA como sustancia antiglucocorticoidea(5). Otros trabajos demuestran las propiedades antiglucocorticoideas, por el específico antagonismo de la acción glucocorticoidea, en diversos modelos animales y en humanos(18). De ésto concluimos que en la relación DHEA/Cortisol se pondría de manifiesto una correlación válida para evaluar "el índice de la función adrenocortical". DHEA y Cognición Estos esteroides muestran diferente comportamiento sobre el SNC. Uno de estos ejemplos es la acción sobre el receptor GABA-A, donde la DHEA actúa como agonista y DHEA-s como antagonista(37). El envejecimiento, en los humanos, se acompaña de una progresiva declinación en la secreción de andrógenos adrenales, como se explicó en párrafos anteriores. Esta disminución fisiológica de las concentraciones de DHEA y DHEA-s se produce paralelamente con el decrecimiento del GH Insulin Growth Factor (GH/IGF-I) perteneciente al eje somatotrófico y del consumo catabólico (relacionado íntimamente con dicho eje). Actualmente no se encuentra totalmente definido el rol biológico de DHEA y su forma sulfatada en la esfera cognitiva pero se especula con la hipótesis de que el descenso de DHEA puede contribuir al cambio desde el anabolismo al catabolismo con la edad(25). La DHEA-s probablemente se involucre en la mejoría de mecanismos cognitivos y de memoria pero algunos trabajos atribuyen este rol a la forma no sulfatada, debido a un mecanismo antioxidante y anticorticoide. En la actualidad existen distintas líneas de investigación que buscan determinar un posible rol de estos andrógenos en los procesos de envejecimiento y de apoptosis neuronal. Algunos de los más importantes se describen a continuación: Tras el conocimiento de las funciones que ejerce la DHEA sobre el aumento del IGF-1(25), la motilidad y crecimiento sobre neuronas neocorticales(6) y la protección de las neuronas hipocampales al agonismo a aminoácidos excitatorios (junto a su forma sulfatada), se puede hipotetizar estos esteroides como un factor que rescataría a las neuronas de la apoptosis(21).

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DHEA no tiene un efecto directo significativo sobre la cognición, pero se vio un efecto neuroprotector y una mejoría en la esfera cognitiva(19). A través de estudios en animales y humanos (a doble ciego contra placebo) se sugiere que el reemplazo con DHEA en pacientes de edad podría tener un rol beneficioso sobre la esfera cognitiva (evaluada psicológica y neuropsicológicamente). Se ve en estos pacientes, de ambos sexos, un aumento en la excreción de DHEA-s, sin modificaciones de IGF-I ni de IGF-III. Los beneficios clínicos no son de gran magnitud en las pruebas citadas(44). Sin embargo, otros trabajos encuentran un aumento de la biodisponibilidad de IGF-I tras la administración de DHEA sin sulfatar en una toma oral nocturna de DHEA de 50 mg/día(25). Hellhammer, de la Universidad de Trier, sostiene que la DHEA, administrada a ancianos en dosis de 50 mg/día vía oral, puede dar una sutil modificación del EEG, pero en los test neurocognitivos a corto plazo no encuentra modificaciones(43). La administracción de DHEA no contrarrestaría los efectos de los corticoides a nivel hipocámpico sobre la memoria, encontrados en el stress. Esto cuestiona la idea de los efectos antiglucocorticoideos de la DHEA sobre el hipocampo(42). Mellon y Compagnone, de la Universidad de San Francisco, publican que la DHEA y la DHEA-s estimulan el crecimiento de células nerviosas que conectan el tálamo con zonas corticales superiores(6). Wolkowitz, de la misma universidad, logra que cepas de ratones aprendan respuestas condicionadas con la misma rapidez que ratas jóvenes tras la administración de DHEA en su alimentación(45). Wolkowitz y Brizendin están trabajando en la administración de DHEA en pacientes con Alzheimer con reportes preliminares de mejoría de la sensación de bienestar y mejoramiento de respuesta a algunos tests de memoria(47). Sin embargo, no existen trabajos de evaluación de estos esteroides en su administración a largo plazo. DHEA y Psiquiatría El eje Límbico-Hipotálamo-Hipófiso-Adrenal (LHHA) es una de las estructuras endócrinas más estudiadas desde la óptica psiquiátrica. La hipercortisolemia, la alteración del ritmo circadiano de secreción de cortisol y la respuesta patológica al DST, han demostrado la alteración cronobiológica de este eje en pacientes con desórdenes afectivos. Es conocido, en la actualidad, que tanto el stress agudo y crónico, como también otros trastornos neuropsiquiátricos llevan implícito alteraciones en el eje adrenal. Este disbalance, consecuentemente, modificará el binding de los receptores a GR y MR a nivel central, que en tales condiciones son menos afines en su capacidad para reducir las concentraciones espontáneas de la elevación de cortisol (por efecto inhibitorio sobre el eje). Dijimos ad supra que la DHEA es una sustancia que posee ritmo circadiano propio e inverso al del cortisol, a diferencia de su forma sulfatada que no posee ritmo propio. Su acción anticorticoidea, mediada por antagonismo de receptores, llevó en los últimos años a estudiar 8

su probable participación tanto en la adaptación al stress como en las enfermedades del espectro depresivo. En el stress agudo los valores de DHEA se hallan disminuídos. En el stress crónico y en la depresión los resultados pueden variar. Los estudios publicados son controversiales. Citaremos algunos de los principales: La medición puntual de DHEA y DHEA-s plasmáticas no muestran diferencias entre pacientes depresivos y controles(32,35). En un pequeño grupo de depresivos con características psicóticas se detecta un incremento de DHEA plasmática(16). La excreción de DHEA en orina de 24 hs. está aumentada en depresivos(40). En depresivos hipercortisolémicos se detecta un incremento diurno de las concentraciones de DHEA mientras que no hay evidencia de falta de ritmo(18). Sería un ritmo inverso. Algunos pacientes con depresión presentaron una mejoría significativa en escalas de depresión y en pruebas de memoria semántica luego de ser tratados con DHEA. Dichas escalas volvieron a los valores iniciales ante la suspensión de la misma, lo que sugiere la acción antidepresiva y promnésica de la DHEA(46). El aumento de DHEA en depresión puede agravar la signo-sintomatología depresiva(18). Las concentraciones de DHEA en pacientes depresivos pueden corresponderse con valores esperables en sujetos controles de menor edad(18). La depresión se asocia a patrones de baja concentración matinal de DHEA y alta concentración vespertina de cortisol(15,17). En una casística de 82 pacientes de entre 8 y 16 años de edad con depresión mayor, se asoció significativamente el aumento de cortisol vespertino en comorbilidad con distimia y en forma independiente del sexo y de la edad. No se pudo reportar positivamente asociaciones comórbidas con la baja concentración de DHEA matinal(17). Herbert y Goodyer observaron que pacientes con ataques de pánico o fobias mostraban significativamente, ausencia de estas anormalidades endócrinas(15,17). En seis pacientes con depresión mayor y bajos niveles de DHEA y DHEA-s se administraron cantidades de DHEA similares a las encontradas en jóvenes sanos. La administración mejoró clínicamente la memoria semántica y la depresión(20). Fava y Rosenbaum mostraron alteraciones en la relación DHEA/cortisol en trastorno de pánico(12). En la actualidad, en el Instituto de Psiquiatría Biológica Integral (ipbi) estamos comparando el ritmo de secreción de DHEA en pacientes depresivos y pacientes psiquiátricos no depresivos. El análisis preliminar de los resultados demuestra una alteración del ritmo circadiano (inversión o falta de ritmo) en los pacientes con desórdenes afectivos. Una próxima evaluación de los datos apuntará a buscar la correlación de dichas alteraciones con variaciones en el ritmo secretorio del cortisol. 9

Administración terapéutica de DHEA Se ha intentado la administración de DHEA con fines terapéuticos en depresión, envejecimiento, trastornos de memoria, diabetes, obesidad, cáncer, enfermedades con deficiencias inmunológicas o como estimulante psicofísico. Sin embargo, con la administración de DHEA en dosis mayores de 5 a 10 mg/día pueden producirse efectos colaterales. Dentro de estos son frecuentes el acné y el aumento de la grasitud, el crecimiento del vello en el rostro y la barbilla de las mujeres, la irritabilidad y el cambio del humor, la sobreestimulación y el insomnio. Son infrecuentes la fatiga y pérdida de energía, cefaleas, irregularidad menstrual y aceleración en la pérdida del cabello. Es importante tener en cuenta que existe un riesgo probable acerca del uso terapéutico de DHEA a largo plazo, determinado por su posible influencia en cáncer hormono-sensibles (mama, útero, ovario y próstata). Asimismo, altas dosis de DHEA por períodos prolongados pueden potenciar procesos de quistes mamarios y fibromas uterinos. Otras posibles modificaciones a largo plazo se pueden presentar en los niveles hemáticos de glucosa, lípidos y hormonas. Conclusiones El eje Límbico-Hipotálamo-Hipófiso-Adrenal es fundamental para la regulación circadiana y homeostática de procesos fisiológicos de suma importancia tales como la cognición, la inmunidad, el metabolismo y la timia. No sólo los productos finales del metabolismo esteroideo, tales como el cortisol y las hormonas sexuales, son claves en esta modulación; los metabolitos intermedios, de los cuales DHEA y DHEA-s forman sólo una parte, también comienzan a ser valorados como imprescindibles en esta función. Su estudio más exhaustivo se hace entonces imperativo. Bibliografía: 1. Abbas KA; Murphy MK; Sher A. "Functional diversity of helper T lymphocytes"; Nature 1996 383: 787-93. 2. Barden N. "Modulation of glucocorticoid receptor gene expression by antidepressant drugs". Pharmacopsychiatry 1996; 29 (1): 12-22. 3. Barrett-Connor E.; Khaw KT.; Yen S. "A prospective study of dehydroepiandrosterone sulfate, mortality and cardiovascular disease". New Engl J of Med; 1986 315 (24): 1519-24. 4. Baulieu EE.; Robel P. "Neurosteroids: a new brain function?". J Steroid Biochem Mol Biol 1990; 37: 395-403. 5. Ben-Nathan D; Kobiler D; Feuerstein G; et al. "Anti-stress effect of Dehydroepiandrosterona (DHEA) on mice inoculated with attenuated arboviruses". Progress in Neuroendocrinoinmunology. 1992; 5 (4): 229-34. 6. Compagnone NA; Mellon SH. "Dehydroepiandrosterone: a potential signalling molecule for neocortical organization during development". Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95 (8): 4678-83. 7. Chiappelli F; Manfrini E; Franceschi C; et al. en: Annals New York Academy of Sciences. "Steroid regulation of cytokines. Relevance for Th1 to Th2 shift?". New York USA. 1995; 205-15. 8. Danenboerg HD; Haring R; Fisher A; et al. "Dehydroepiandrosterone increases production and release of Alzheimer´s amyloid precursor protein". Life Sci. 1996; 59 (19): 1651-7. 9. Daynes RA; Dudley DJ; Araneo BA. "Dehydroepiandrosterone is a natural enhancer of interleukin 2 synthesis by helper T cells". Eur J Inmunol. 1990; 20 793-802. 10. Dhom G. "Prepubertal and pubertal growth of the adrenal (adrenarche)". Beitr Pathol 1973; 150: 357-377. 11. Dunn JF; Nisula BC; Rodbard D. "Transport of steroid hormones: Bindig of 21 endogenous steroids to both testosteron-binding globulin and corticosteroid-binding globulin in human plasma". J Clin Endocrinol Metab. 1981; 53: 58-68. 12. Fava M, Rosenbaum JF, MacLaughlin RA, et al. "Dehidroepiandrosterone-sulfate/cortisol ratio in panic disorder". Psychiatry Res 1989 28 (3): 345-50. 13. Garside P; Mowat A. "Polarization of Th-cell responses : a phylogenetic consequence of nonspecific imnune defence?". Inmunol Today 1995 16 (5):120-23. 14. Gold PW, Licino J, Wong ML, et al. "Corticotropin releasing hormone in the pathophysiology of melancholic and atypìcal depression and in the mechanism of action of antidepressant drugs". Ann N Y Acad Sci 1995; 771: 716-29. 15. Goodyer IM, Herbert J, Altham PM, et al. "Adrenal secretion and major depression in 8- to 16-year olds. I Altered diurnal rhythms in salivary cortisol and dehydroepiandrosterone (DHEA) at presentation". 1996; Psychol Med 26 (2): 245-56. 16. Hansen CR.; Kroll F.; Mac Kensie TB. "Dehidroepiandrosterone and affective disorders". Am J Psychiatry 1982; 139: 386-7. 17. Herbert J, Goodyer IM, Altham PM, et al. "Adrenal secretion and major depression in 8- to 16-year olds. II Influence of co-morbidity at presentation". Psychol Med. 1996 26 (2): 257-63. 18. Heuser I, Deuschle M, Luppa P, et al. "Increased diurnal plasma concentrations of dehidroepiandrosterone in depressed patients". J Clin End Metab. 1998; 83 (9) 3130-33. 19. Heuser I. 1998; in XXIX th Congress of International Society of Psychoneuroendocrinology (ISPNE). Europahalle Trier, Germany.

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"Glucocorticoid receptor number and cortisol excretion in mood, anxiety, and psychotic disorders". Biol Psychiatry. 1993; 34 (1-2): 18-25. 1 Médica-psiquiatra. Presidente de la Sección de Psiquiatría Biológica de la Asociación Argentina de Psiquiatras. Directora del Instituto de Psiquiatría Biológica Integral (ipbi). Azcuénaga 1077 3º "B". Tel/Fax# (54-11) 4821-4363; 4823-9347. E-mail: [email protected]

Neurosteroid Quantification in Human Brain Regions: Comparison between Alzheimer’s and Nondemented Patients Sébastien Weill-Engerer, Jean-Philippe David, Véronique Sazdovitch, Philippe Liere, Bernard Eychenne, Antoine Pianos, Michael Schumacher, André Delacourte, EtienneEmile Baulieu and Yvette Akwa INSERM, U-488 (S.W.E., P.L., B.E., A.P., M.S., E.E.B., Y.A.), 54276 Le Kremlin-Bicêtre, France; Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Hôpital Rothschild, Service de Gériatrie (S.W.E.), 75012 Paris, France; INSERM, U-422 (J.P.D., A.D.), 59045 Lille, France; Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Hôpital Emile Roux, Service de Gérontologie 3 11

(J.P.D.), 94456 Limeil Brevannes, France; and Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Service d’Anatomie Pathologique Neurologique, Hôpital Pitié-Salpêtrière (V.S.), 75013 Paris, France Address all correspondence and requests for reprints to: Sebastien Weill-Engerer, M.D., INSERM, U-488, Stéroïdes et Système Nerveux, 80 rue du Général Leclerc, 94276 Le Kremlin-Bicêtre, France. E-mail: [email protected] .

Abstract Some neurosteroids have been shown to display beneficial effects on neuroprotection in rodents. To investigate the physiopathological significance of neurosteroids in Alzheimer’s disease (AD), we compared the concentrations of pregnenolone, pregnenolone sulfate (PREGS), dehydroepiandrosterone, dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), progesterone, and allopregnanolone, measured by gas chromatography-mass spectrometry, in individual brain regions of AD patients and aged nondemented controls, including hippocampus, amygdala, frontal cortex, striatum, hypothalamus, and cerebellum. A general trend toward decreased levels of all steroids was observed in all AD patients’ brain regions compared with controls: PREGS and DHEAS were significantly lower in the striatum and cerebellum, and DHEAS was also significantly reduced in the hypothalamus. A significant negative correlation was found between the levels of cortical ß-amyloid peptides and those of PREGS in the striatum and cerebellum and between the levels of phosphorylated tau proteins and DHEAS in the hypothalamus. This study provides reference values for steroid concentrations determined by gas chromatography-mass spectrometry in various regions of the aged human brain. High levels of key proteins implicated in the formation of plaques and neurofibrillary tangles were correlated with decreased brain levels of PREGS and DHEAS, suggesting a possible neuroprotective role of these neurosteroids in AD. A VARIETY OF STEROIDS can be synthesized in the rodent brain independently of peripheral glandular sources. Such steroids formed within the brain from cholesterol are defined as neurosteroids (1). Among them, neuroactive neurosteroids are allosteric modulators of the neurotransmitter receptor activities (2), hence regulating different aspects of animal behavior (3, 4). Particularly relevant to the aging process and Alzheimer disease (AD) are the beneficial effects of neurosteroids on memory (5) and neuroprotection against the ß-amyloid peptide-induced neurotoxicity in vitro (6, 7, 8). In the human brain some studies have reported quantification of several neurosteroids, such as pregnenolone (PREG; 3ß-hydroxy-pregn-5ene-20-one), pregnenolone sulfate (PREGS), dehydroepiandrosterone (DHEA; 3ß-hydroxyandrost-5-ene-17-one), DHEA sulfate (DHEAS), and allopregnanolone (3 ,5 -THP; 3 hydroxy-5 -pregnan-20-one). However, most of them have used subjects with a wide range of ages, between 2–85 yr (9, 10, 11), except for the one by Lacroix et al. (12) that used 76- to 93yr-old subjects whose neurological status was not mentioned. Normal aging is accompanied by numerous physiological, behavioral, and hormonal changes. One of the most prominent endocrine changes is the continuous decrease with age in the blood levels of steroids. Besides the age-related decrease in circulating concentrations of estradiol (in menopause) and testosterone (in andropause), a significant fall also occurs in plasma in both women and men, for PREG, PREGS, DHEA, DHEAS, and 3 ,5 -THP (13). Whether the profound age-related reduction in the blood concentrations of these steroids is associated with AD is still unclear. Only DHEAS and DHEA have been measured in the blood of AD patients in comparison with nondemented controls, but results were rather contradictory (14, 15, 16,

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17). To the best of our knowledge, there is no study examining the brain levels of neurosteroids in AD patients. To gain a better knowledge of the role of neurosteroids in dementia, we compared their concentrations in several brain regions between AD patients and aged nondemented controls. We also investigated the possible relationship between the neurosteroid levels and specific structural brain abnormalities related to AD, such as the extracellular senile plaques composed of ß-amyloid peptides (Aß) and the intracellular neurofibrillary tangles (NFT) constituted of intraneuronal bundles of paired helical filaments (PHF) that result from the aggregation of pathologic tau proteins (PHF-tau) (18, 19).

Subjects and Methods Subjects Eleven patients (median age, 86.3 yr; minimum, 75.6 yr; maximum, 91.5 yr) were selected for the study. They were hospitalized and died in a geriatric unit (Service de Gérontologie 3, Hôpital Emile Roux, Limeil-Brévannes, France). Exclusion criteria were a postmortem delay beyond 24 h, steroid or benzodiazepine administration during the month before death, and prolonged hypoxemia at the time preceding death. Dementia was considered using the criteria of Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (20), and criteria of AD were those proposed by the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and StrokeAlzheimer’s Disease and Related Disorders Association (21). All patients had a full clinical evaluation of neurological status and a specific complementary evaluation (cerebral tomography, electroencephalography, serological tests for syphilis and human immunodeficiency virus, and serum determinations of thyroid function, vitamin B12, folates, and calcium). At the time of autopsy, one hemisphere of each brain was formalin-fixed for neuropathological examination, and the other one was deep-frozen at -80 C until biochemical analysis. Patients were included on the basis of their clinical and biological diagnoses. The diagnosis of AD was excluded for six patients (nondemented control group: two women and four men) and was sustained for five others (AD group: four women and one man). All clinical investigations described here were approved by the local committee and conducted in accordance with the Declaration of Helsinki. Neuropathological examination of brain samples The neuropathological features of all patients were evaluated as in a previous study (22) and are detailed in Table 1 . Briefly, the presence of amyloid plaques and NFT were scored in cortical and subcortical areas according to Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease criteria (23) and Braak and Braak’s stages (24), respectively. Quantification of amyloid depositions was performed by counting the number of plaques per square millimeter, using thioflavine S and antibodies against Aß peptides, i.e. monoclonal Aß 8–17 (DAKO Corp., Carpinteria, CA) or polyclonal antibodies against the N- and C-terminal partd of Aß 1– 40 and Aß 1–42 (INSERM, U-422, Lille, France). NFT were quantified by counting the numbers per square millimeter using monoclonal antibody AD2 directed against PHF-tau (25). View this table:

Table 1. Neuropathological features of the aged nondemented and Alzheimer’s patients

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Collection of brain regions Upon thawing of one cerebral hemisphere at -10 C, large portions of hippocampus, amygdala, frontal cortex, striatum, hypothalamus, and cerebellum were dissected out, and representative fractions of 100 mg of each brain structure were collected and immediately stored at -80 C. From a total of 66 samples (11 patients x 6 brain regions) to be collected, 7 samples (1 hippocampus and 2 amygdala from controls as well as 2 amygdala and 1 hypothalamus from AD patients) were not included in the study because of difficulties in definite identification. Biochemical analysis of Aß and PHF-tau proteins The levels of Aß were quantified in homogenates of frontal cortex as in a previous study (22). Briefly, Aß was identified by dot blot using the same immunological probes as those used for amyloid plaque detection, according to the procedure developed by Permanne et al. (26) and was quantified using the ImageMaster program developed by Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). The levels of PHF-tau proteins were determined in all the brain regions collected. PHF-tau proteins were immunodetected by Western blot using monoclonal antibody AD2 as described for NFT detection, according to the method reported by Sergeant et al. (27). They were quantified, using the ImageMaster program, by measuring the area of the peaks corresponding to tau 55, 64, and 69, which were then scored by comparison with a temporal cortex homogenate from a patient with early-onset AD, considered as a positive internal standard, as previously described (28). Biochemical analysis of steroids The method used for steroid analysis was previously described and validated (29). Briefly, after adding 3ß,5ß-tetrahydroandrostenedione (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) as the internal standard for PREG, DHEA, progesterone (PROG), 3 ,5 -THP, and [2H4]PREGS ([17,21,21,21-2H]PREGS, trimethyl ammonium salt, prepared by Dr. R. Purdy, La Jolla, CA) as the internal standard for PREGS and DHEAS, the steroids were extracted by methanol 100%. The sulfated and unconjugated steroids were separated and purified by chromatography on AMPREP silica minicolumns C18 (Amersham International, Little Chalfont, UK) using solutions of MeOH-H2O [40:60, (vol/vol) and 85:15 (vol/vol), respectively]. The sulfated steroid fraction was solvolysed with ethyl acetate containing 0.2% 0.5 M H2SO4 (30) at room temperature for 1 h. The unconjugated steroid fraction was submitted to HPLC. The HPLC system from Thermoquest (San Jose, CA) consisted of a P1000XR quaternary pump and an AS 100 XR TSP autoinjector. HPLC was achieved with a Lichrosorb Diol column (25 cm x 4.6 mm, 5 µm). The solvent system consisted of hexane and mixture A (90:10, vol/vol), the latter composed of hexane-isopropanolol (85:15, vol/vol). The elution was performed at a flow rate of 1 ml/min. The elution profiles of PREG, DHEA, PROG, and 3 ,5 -THP were identical to those previously reported (29). The unconjugated steroids from the HPLC fractions and those obtained after solvolysis were then derivatized separately with anhydre heptafluorobutyric acid (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) before injection into the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) system. GC was performed in the splitless mode with a GC 8000 Top gas chromatograph (Carlo Erba, Milan, Italy). The mass spectrometer (model 150, Finnigan Automass, Argenteuil, France) was operated in the electron impact mode. Identification was performed in the full-scan mode, and 14

quantification was performed in the single ion monitoring mode. Each GC-MS measurement was made in duplicate. Statistical analysis Nonparametric tests were used. The Kruskal-Wallis test was used for overall comparisons between the two groups of patients and followed, when significant, by the Mann-Whitney test applied region by region. The Friedman test was used for overall comparisons between regions and followed, when significant, by the Wilcoxon test. Statistical associations between two sets of independent and continuous data were assessed by the Spearman test. Data are presented as the mean ± SEM. Significance was defined at P < 0.05.

Results Age and sex characteristics Six patients were assigned to the control group, and five patients constituted the AD group. In the control and AD groups, the median ages were 87.1 and 86.0 yr, respectively, and there was no significant difference in age (P > 0.999) or in sex ratio (by Fisher’s exact test, P = 0.242) between the two groups. Women were slightly older than men (median, 87.9 and 86.0 yr, respectively), but no significant difference was found with age according to sex (P = 0.361). Steroid quantification in brain regions As indicated in Figs. 1–3 the steroids found at the highest concentrations were in decreasing order (PREG > DHEA > PROG, > PREGS > DHEAS >> 3 ,5 -THP) in all regions of both groups. No difference was noted between regions in the AD group. In contrast, a significant overall difference between regions was observed in the control group for each steroid measured (PREGS, P < 0.05; other steroids, P < 0.01), except for 3 ,5 -THP (P = 0.097). In this group, regions containing the highest levels of steroids were, in decreasing order, hypothalamus > striatum > frontal cortex > cerebellum > amygdala hippocampus. Region by region comparisons in the control group revealed that the levels of all steroids measured, except 3 ,5 -THP, were always significantly lower in the hippocampus and frontal cortex than in the hypothalamus (P < 0.05) and also in the striatum for the sulfated steroids (P < 0.05). Moreover, free steroids (i.e. PREG, DHEA, and PROG) exhibited a significantly lower level in the cerebellum than in the hypothalamus (P < 0.05). Figure 1. Concentrations of PREGS and DHEAS in six brain regions of nondemented ( ) and AD ( ) patients. HC, Hippocampus; A, amygdala; FC, frontal cortex; ST, striatum; HT, hypothalamus; C, cerebellum. Values are the mean ± SEM. *, P < 0.05 (by Mann-Whitney test).

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Figure 2. Concentrations of PREG and DHEA in six brain regions of nondemented ( ) and AD ( ) patients. HC, Hippocampus; A, amygdala; FC, frontal cortex; ST, striatum; HT, hypothalamus; C, cerebellum. Values are the mean ± SEM.

Figure 3. Concentrations of PROG and 3 ,5 -THP in six brain regions of nondemented ( ) and AD ( ) patients. HC, Hippocampus; A, amygdala; FC, frontal cortex; ST, striatum; HT, hypothalamus; C, cerebellum. Values are the mean ± SEM.

A general trend toward lower levels of steroids was observed in the six brain regions of the AD patients compared with the controls. An overall significant regional difference was found between the two groups for PREGS (P < 0.001) and DHEAS (P < 0.001; Fig. 1 ). PREGS was significantly lower in the striatum (P < 0.05) and cerebellum (P < 0.05) of AD patients than in controls and was close to a significant level of difference in the frontal cortex (P = 0.068). DHEAS was significantly lower in the AD group compared with controls in the striatum (P = 0.029), cerebellum (P = 0.011), and hypothalamus (P = 0.019). Relationship among the levels of brain steroids, PHF-tau proteins, and Aß The levels of PHF-tau proteins were significantly higher in the AD group compared with the controls in all brain regions (P < 0.05) except the amygdala, for which the difference was just above the level of significance (P = 0.077) despite the four samples missing, and the cerebellum, in which PHF-tau proteins were undetectable in all patients (Fig. 4 ). A significant negative correlation was observed between the PHF-tau proteins and DHEAS levels in the hypothalamus (P < 0.05; = -0.717), and no relationship was found for the other steroids analyzed.

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Figure 4. Concentrations of PHF-tau in six brain regions of nondemented ( ) and AD ( ) patients, expressed as a percentage of the positive control value (22 ). HC, Hippocampus; A, amygdala; FC, frontal cortex; ST, striatum; HT, hypothalamus; C, cerebellum; n.d., not detected. Values are the mean ± SEM. *, P < 0.05; **, P < 0.01 (by Mann-Whitney test). The levels of Aß in the frontal cortex were significantly higher in the AD patients compared with the control group (respectively, 67.8 ± 20.8 and 2.2 ± 2.0 nmol/kg brain tissue, respectively; P = 0.008). A significant negative correlation was found between the levels of cortical Aß and PREGS in the striatum (P < 0.05; = -0.718) and cerebellum (P < 0.05; = 0.729). DHEAS concentrations were also negatively correlated with Aß levels in these two structures, but were at the threshold of significance (P = 0.094 and P = 0.055, respectively). In the other brain regions studied, there were no significant correlations between the levels of Aß and those of DHEAS, PREGS, or any other steroid.

Discussion The present study is the first report, to the best of our knowledge, of a comparative analysis of the concentrations of several neurosteroids, determined by GC-MS, in various brain regions between aged AD patients and aged nondemented controls. Compared with RIA, the technique employed here, coupling HPLC and GC-MS, offers the advantages of high sensitivity and specificity and allows the simultaneous quantification of different steroids in individual tissue samples (29). This methodology allowed us to compare the levels of various neurosteroids in specific brain regions between AD patients and nondemented controls. Despite the rise in interindividual variability that occurs during aging, differences in brain steroid levels between the AD group and controls were observed. In the human brain, numerous steroids have already been quantified, such as PREG and DHEA (12, 31), PREGS and DHEAS (31), PROG (10, 11, 31), and 3 ,5 -THP (10). To date, no study has used GC-MS technology to quantify steroids in the human brain, thus making difficult the comparison of our GC-MS values with the previously published RIA measurements. In addition, only a few studies have analyzed more than three human brain regions, and the regions that were chosen were generally different from one study to another (9, 10, 12, 31). According to previous measurements of neurosteroids in the human brain using RIA, only the study by Lanthier et al. (31) has provided data on the levels of PREGS and DHEAS in brain regions of five patients. These researchers also assayed PREG and DHEA, as did Lacroix et al. (12), specifically in the cortex and cerebellum of 10 subjects. Comparisons between our data and those of the cited studies revealed that the differences in the concentrations of neurosteroids (PREG, DHEA, PREGS, and DHEAS) in control patients are limited to the hypothalamus, where our values were 2- to 4-fold higher than those found by the others. Apart from this difference, our steroid measurements in the frontal cortex, amygdala, and hippocampus are in the same range and, to the best of our knowledge, we are the first to describe the concentrations of PREG, DHEA, PREGS, and DHEAS in the striatum. In the previous reports old subjects were used, but their neurological status was not described despite

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the high prevalence of neurological diseases in this age class. Significant differences between the two groups of patients were found in several regions for DHEAS and PREGS. It is of importance to highlight that these two steroids are those that have shown the greatest evidence for a neuroprotective effect (8, 32, 33, 34, 35). Cerebral concentrations of DHEA and PREG in the present study were much higher (in the range of 5.69–201.99 nmol/kg for DHEA and 11.09–1011.33 nmol/kg for PREG, depending on the brain regions) than those reported in the blood of very old patients (13, 36, 37), consistent with the postulate of local production of DHEA and PREG in the human brain. Measurements of PROG in specific regions of the brain of elderly subjects have been reported, but a great heterogeneity could be observed among the values. Overall values from the control patients of our study are either clearly higher than some of those previously reported (10, 11, 12, 31) or very similar to those of the oldest subgroup (women; median age, 75 yr) of subjects in the study by Bixo et al. (10). To date, quantification of 3 ,5 -THP in the human brain has only been reported in one study (10). In that work, conducted upon much younger subjects than those in our study, the 3 ,5 -THP values were 20 times higher in the cortex and hypothalamus and 30 times higher in the striatum and cerebellum compared with those in the corresponding brain areas in the controls of the present study. AD is the most common cause of dementia in the elderly. One line of research to explain the pathogenesis of this neurological disorder is currently oriented toward examination of the possible relationships between specific structural, metabolic, and neurochemical brain abnormalities (for review, see Ref. 38). Natural progression of AD involves first the hippocampus and neocortex, but also other areas of the limbic system, such as the amygdala and olfactory bulbs (39), and extends progressively to cortical brain areas during the course of AD (22). The involvement of basal nuclei, such as hypothalamus or striatum, and the cerebellum occurs later in the progression of the disease (40, 41). We demonstrate here for the first time that two biochemical hallmarks of AD, namely PHFtau and Aß, are correlated with the levels of the neurosteroids PREGS and DHEAS in distinct brain regions. Our results revealed that PHF-tau levels were significantly and negatively correlated with the DHEAS concentration in the hypothalamus. They also indicated that the levels of cortical Aß were significantly and negatively correlated with PREGS levels and to some extent with DHEAS in the striatum and cerebellum. It is known that a widespread neuronal loss occurs during the course of AD that could be in part causal or consecutive to the lower steroid levels observed in AD brains. The absence of a relationship between the levels of PHF-tau and steroids, particularly in the hippocampus and cerebral cortex, is consistent with the fact that NFT, which are the histological hallmark of high levels of PHF-tau, are known to always be present in the hippocampus and entorhinal cortex of very old patients regardless of their state of dementia (22, 42, 43). These findings are supportive of the role of DHEAS in the protection against Aß-induced neurotoxicity (7, 8) and in the enhancement of Amyloid precursor protein production (44). In conclusion, this study provides reference values, determined by GC-MS, for steroid concentrations in various regions of the aged human brain. High levels of key proteins implicated in the formation of plaques and NFT were correlated with decreased brain levels of PREGS and DHEAS, thus suggesting a possible protective role for these neurosteroids in the dementia related to AD.

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